高效液相色谱法测定葡萄酒中阿斯巴甜、阿力甜和纽甜的含量

季 磊，陈 博，马晓健

(大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁 大连 116021)

甜味剂是赋予食品甜味的物质，[1]是一类有着广泛应用的食品添加剂。甜味剂具有增加食品的甜度、增强口感和改善风味等作用，按照其来源可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂。[2]人工合成的甜味剂包括二肽类、磺酰胺类和蔗糖衍生物。其中，阿斯巴甜、阿力甜和纽甜都属于二肽类人工合成甜味剂，[3]具有甜度高、不提供能量、价格便宜等特点。但是如果过量使用甜味剂，有可能会对身体健康产生不良影响。[4]

根据GB/T 15037-2006标准规定，[5]葡萄酒应该以葡萄或葡萄汁发酵酿制而成，生产过程中不允许添加甜味剂。目前检测二肽类甜味剂阿斯巴甜、阿力甜和纽甜含量的方法主要有表面增强拉曼光谱法[6]、高效液相色谱法[7-8]、高效液相色谱-质谱联用法[9-10]和离子色谱法[11]等方法。本研究使用高效液相色谱法同时测定葡萄酒中阿斯巴甜、阿力甜和纽甜的含量，处理方法简单，结果准确。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪Alliance 2695/2996、固相萃取柱Oasis MAX 3mL/60mg，美国沃特世Waters；色谱柱Poroshell EC-C18(2.7μm，4.6mm×100mm)，美国安捷伦Angilent；电子天平BSA224S、超纯水系统，德国赛多利斯Sartorius；旋涡混合器XW-80A，上海精科实业有限公司；24位氮吹仪，美国Organomation；超声波清洗器SK8300GT，上海科导超声仪器有限公司；阿斯巴甜(含量：94.49%)，德国Dr.Ehrenstorfer；阿力甜(含量：98%)，美国Panphy；纽甜(含量：98%)，加拿大TRC；甲醇、乙腈，色谱纯；氨水、甲酸，分析纯。

1.2 测定方法

1.2.1 样品处理

将样品混匀并超声10min除去二氧化碳，称取2g样品于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀。取出1mL容量瓶中液体于玻璃试管中，加入2mL 2%氨水溶液，旋涡混合器震荡1min。试管中液体全部过用3mL甲醇和3mL水活化的MAX固相萃取柱(3mL/60mg)，分别用3mL水和3mL甲醇淋洗，弃去全部淋洗液，再使用6mL 4%甲酸-甲醇溶液洗脱，收集全部洗脱液，40℃水浴氮气吹干。残余物用10%乙腈-水溶液定溶至1mL，旋涡混合器震荡1min。过0.22μm微孔滤膜，待测。

1.2.2 液相色谱检测条件

色谱柱为Poroshell EC-C18(2.7μm，4.6mm×100mm)，柱温30℃，进样量30μL；检测器波长205nm；流动相A为纯水，流动相B为乙腈，洗脱梯度见表1。

表1 液相色谱洗脱梯度

2 结果

2.1 标准曲线

分别称取一定量的阿斯巴甜、阿力甜和纽甜标准品至100mL容量瓶中，用10%乙腈-水溶液定容，配制成含量为100mg/L的混合标准储备溶液。分别取10μL、25μL、50μL、250μL、500μL和1500μL的标准储备溶液于50mL容量瓶中，用10%乙腈-水溶液定容，配制成含量分别为0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L和3.00mg/L的上机工作溶液，绘制成标准曲线，溶液中化合物的含量(mg/L)为横坐标x，色谱峰面积为纵坐标y。三种化合物的相关系数均大于0.9995，线性关系较好。所得曲线和相关系数见表2。

表2 标准曲线及相关系数

2.2 回收率试验及定量限

取适量的标准溶液加入样品中，每个浓度6个平行，经1.2.1处理后测定，分别计算三种化合物的回收率和相对标准偏差(RSD)。经计算，当阿斯巴甜、阿力甜和纽甜的添加量为0.1mg/kg时，测定结果信噪比S/N>10，回收率大于83%，同时相对标准偏差小于6%，本方法中阿斯巴甜、阿力甜和纽甜的定量限均确定为0.1mg/kg。添加回收试验中，阿斯巴甜回收率在85.2%～93.5%之间，相对标准偏差(RSD)小于6%，阿力甜回收率在82.7%～91.5%之间，相对标准偏差(RSD)小于6%，纽甜回收率在90.3%～96.4%之间，相对标准偏差(RSD)小于4%。样品添加量和结果见表3，色谱图见图1。

表3 样品添加量、回收率和相对标准偏差

图1 空白样品色谱图及三种化合物加标样品色谱图

3 讨论

3.1 检测器波长的选择

空白样品经过1.2.1处理，加入阿斯巴甜、阿力甜和纽甜配制成1mg/L的混合标准溶液，在190nm～400nm检测波长条件下进行扫描。经过比较，波长205nm条件下三种化合物都有较大响应且干扰较少。

3.2 样品处理方法的选择

在二肽类甜味剂的检测中，最常见的样品处理方法主要有以下两种：样品经过稀释过滤后检测[12-13]和用固相萃取柱净化样品[14-15]之后检测。本次研究首先使用纯水稀释后过滤样品提取液的方法处理样品，经过检测杂质对三种化合物的检测效果都有一定影响，其中对纽甜的影响相对较小。

通过比较使用C18固相萃取柱[15-16]、HLB固相萃取柱[14]和MAX固相萃取柱处理样品的结果，三种固相萃取柱对去除样品中杂质的干扰都有一定的效果，其中MAX固相萃取柱的净化效果相对较好，净化后杂质对三种化合物的检测影响都比较小。本次研究最终选择使用MAX固相萃取柱净化样品。

3.3 液相色谱条件的选择

本次研究比较了使用不同比例的甲醇、乙腈、水和硫酸铵溶液[17]作为流动相，化合物色谱图的峰面积、峰高、保留时间和分离度等因素。在使用同样色谱柱的条件下，使用甲醇或乙腈作为有机相，三种化合物的峰面积没有很大差别，使用乙腈时的峰高大约是使用甲醇时的两倍；使用硫酸铵溶液作为流动相对改善目标化合物的出峰有一定效果；使用梯度洗脱时三种化合物的峰形明显好于等度洗脱，且梯度洗脱条件下更容易与杂质分离。综合考虑样品检测的情况，为了使方法更加简单、快速、高效，本方法选择使用乙腈-水流动相梯度洗脱检测样品。

4 结论

本次研究采用固相萃取法处理样品，利用高效液相色谱法建立了葡萄酒中阿斯巴甜、阿力甜和纽甜含量的检测方法。经过验证，本方法的准确度、精密度、定量限和回收率都满足检测需求，可以用于葡萄酒中阿斯巴甜、阿力甜和纽甜的含量的检测。