长链非编码RNA FTX通过PPARγ影响肠癌细胞的增殖、迁移和糖酵解

马晶晶 杨金兰 屈天银 喻皇飞

遵义市第一人民医院（遵义医科大学第三附属医院）1检验科，2肿瘤科（贵州遵义 563000）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤，发病率在我国呈逐年上升趋势，严重威胁人民群众健康［1］。在肿瘤生长过程中，随着瘤体逐渐增大及肿瘤内环境的改变，癌细胞利用葡萄糖供能从有氧糖代谢转向有氧糖酵解，使得其在相对缺氧的状态下适应环境的改变而持续增殖生长，从而产生瓦伯格效应（warburg effect），是实体恶性肿瘤的重大生物学特征之一［2］。所以，从癌细胞糖能量代谢的角度入手深入研究CRC 的发病机制，对健康中国战略下的CRC 防治具有重要意义。

长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是生物体内长度超过200 bp 的、不具备蛋白质编码功能的一类RNA［3］。研究［4］证实LncRNA 在肿瘤中异常表达，参与肿瘤的发生发展。LncFTX 是由位于X 染色体失活区域（X chromosome inactivation，XCI）的非蛋白质编码基因FTX（five prime to Xist）转录而来，由2 300 bp 组成［5］。FTX 在进化上高度保守，位于人染色体X q13.2 区域，曾一度被认为是“无用的废弃基因”。随着研究的不断深入，发现LncFTX 在恶性胶质瘤［6］、肝癌［7］、胃癌［8］以及肺癌［9］等多种肿瘤中作为促癌因子存在，刺激癌细胞的恶性生物学行为。LncFTX 同样在肠癌组织中异常表达［10］，但其与肠癌细胞糖能量代谢之间的关系不是十分清楚。本研究拟探索LncFTX 在肠癌细胞中对葡萄糖代谢和癌细胞增殖迁移行为的影响，为深究其参与肠癌发生发展机制提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系与主要试剂肠癌细胞株HT-29、SW480、HCT116 以及正常肠黏膜上皮细胞株NCM-460细胞购自中国科学院上海细胞库；DMEM培养基、胎牛血清购自GIBCO 公司；转染试剂lipofectamine 2000 购自Invitrogen 公司；PPARγ、PDHA1、Glut4、TNF α、Leptin 兔抗人多克隆抗体均来自ABclonal公司；HRP 标记羊抗兔二抗来自武汉博士德公司，RIPA 裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司，pcDNA3.1 PPARγ 过表达质粒及相应空载体购自湖南优宝生物科技有限公司；siRNAs 购自上海吉玛制药技术有限公司；PPARγ 激动剂Pioglitazone购自美国MCE 公司；果糖磷酸激酶（PFK）检测试剂盒、柠檬酸合成酶（CS）检测试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司。本研究经医院伦理委员会同意并批准。

1.2 细胞培养及转染肠癌HT-29、SW480、HCT 116 细胞株及正常肠黏膜上皮细胞NCM-460 细胞均用含10%胎牛血清的DMEM 完全培养基（含双抗）在37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。HT-29细胞转染前一天按2 × 104个/mL 密度种植于六孔板中，待细胞生长到一定密度（60%～70%）时，参照Lipofectamine 2000 试剂说明书的方法进行转染。分别将si-FTX、si-NC 及pcDNA3.1 PPARγ 及相应阴性对照质粒转染至HT-29 细胞中，同时设空白对照组。转染6 h 后换液，继续培养48 h。所用si-LncFTX 干扰序列：Forward 5'-GCUGAAACUUCAGUACUUATT-3'，Reverse 5'-UAAGUACUGAAGUUUCAGCTT-3'。

1.3 实时荧光定量PCR取对数生长期细胞，严格按照RNA 抽提试剂盒说明书要求提取总RNA，进行核酸定量，然后按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。最后按qRT-PCR 试剂盒说明书进行LncFTX 和PPARγ 检测。用2-△△Ct法计算两者相应mRNA 的表达。引物序列见表1。

表1 所用引物序列Tab.1 Sequence of primers used in the experiment

1.4 CCK-8 实验检测细胞增殖实验按CCK-8试剂盒操作说明进行，具体步骤如下：收集各组细胞，按5 × 103个/孔接种于96 孔板中，各组均设3个复孔，每孔加入90 μL新鲜培养液并加入10 μL CCK-8 溶液，轻微混匀，在37 ℃孵箱内孵育2 h，采用酶标仪测定各孔450 nm 处的吸光度（A450）值。统计分析时，将对照组的OD值标定为100%，根据实验各组与对照组的OD值比值，算出各组的相对增殖速度。以上实验做3 次重复。

1.5 Transwell 实验检测细胞迁移能力取处理好的HT-29 细胞，0.25%胰酶分别消化收集，无血清DMEM 培养基悬浮细胞，调整细胞浓度至3 ×105个/mL 备用。在24 孔板中预先加入800 μL 10%FBS 的DMEM 培养基，并放入Transwell 小室，1 h后在Transwell 上室分别接入200 μL 各组细胞悬液，37 ℃，5% CO2培养箱培养24 h 后取出transwell小室，用PBS 小心清洗小室，用70%冰乙醇溶液固定细胞后以0.5%结晶紫染液在室温条件下染色20 min，PBS 洗涤后用干净的棉球将上室一侧的未迁移的细胞擦干净，置于显微镜下观察拍照。

1.6 蛋白质印迹法（western blot，WB）收集经处理后的细胞，PBS 洗涤后每孔加入80 μL通用型蛋白裂解液提取蛋白，进行蛋白浓度定量。分别配制12%的分离胶、5%的浓缩胶进行SDS-PAGE凝胶电泳分离目标蛋白，PVDF膜转膜后利用5%脱脂奶粉封闭2 h；然后分别加入一抗PPARγ（1∶1 000）、PDHA1（1∶1 000）、Glut4（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、Leptin（1∶1 000）4 ℃过夜，用含Tween-20 的Tris-HCl 缓冲盐溶液（TBST）洗膜3 次，每次10 min；按1∶5 000 的比例加入HRP 标记的羊抗兔二抗，在室温下孵育2 h 后，TBST 洗膜3 次，用ECL 显色液显色，Image J 软件对条带进行灰度分析。

1.7 酶联免疫吸附试验（ELISA分析）按照PFK、

LDH、CS 检测试剂盒说明书进行各组细胞中PFK、LDH、CS 含量检测。多功能酶标仪测各组OD值，每组设三个复孔。受测样本OD=（测定OD-对照OD）/（标准OD-空白OD）。

1.8 统计学方法采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncFTX 促进肠癌细胞的增殖和迁移利用

RT-qPCR 检测LncFTX 在正常肠黏膜上皮NCM-460 细胞和肠癌HT-29、HCT116 和SW480 三种不同瘤株细胞中本底表达，发现其在三种肠癌细胞中的表达均明显高于正常肠粘膜细胞。相比而言，LncFTX 在HT29 细胞中的本底表达水平最高（图1A）。故此选择在HT-29 细胞中利用siRNA 干扰LncFTX的表达（图1B），发现下调LncFTX表达后的HT29细胞的增殖（图1C）和迁移能力（图1D-1E）均受到了明显抑制。结果提示LncFTX 不仅在肠癌细胞中高表达，还参与了HT-29 细胞的增殖和迁移行为。

图1 LncFTX 促进肠癌细胞的增殖和迁移Fig.1 LncFTX promotes the proliferation and migration of colorectal cancer cells

2.2 LncFTX 促进肠癌细胞有氧糖酵解过程为进一步验证LncFTX 对HT-29 肠癌细胞糖能量代谢过程的影响，利用siRNA 下调LncFTX 表达后发现HT-29 细胞中Glut4 表达明显减少（图2A），但PDHA1 却明显升高。同时ELISA 检测细胞内PFK和LDH 的含量分别为（0.14 ± 0.02）U/mg 和（72.03± 14.64）U/L，均明显低于空白组和干扰对照组（P＜0.05）。而CS 的含量则明显升高，从对照组的（4.22±0.20）U/mg升至（8.07±0.50）U/mg（P＜0.05，图2B-D）。提示下调LncFTX 可能使得HT-29 细胞的葡萄糖摄入下降，细胞内乳酸生成减少，同时让细胞内的葡萄糖进入三羧酸循环代谢。

图2 LncFTX 促进肠癌细胞有氧糖酵解过程Fig.2 LncFTX promotes aerobic glycolysis of colorectal cancer cells

2.3 LncFTX调节PPARγ及其下游基因的表达通过生物信息学分析预测LncFTX 可能与PPARγ关联，提示LncFTX 对HT-29 细胞的糖能量代谢与其对PPARγ 的调控有关。进一步的实验发现下调HT-29 细胞中LncFTX 表达 后，PPARγ 无论是在mRNA 水平（图3A）还是在蛋白水平均较空白和对照组明显下降。而Leptin、TNFα 作为下游蛋白，受到PPARγ 的负调控，在LncFTX 被抑制后两者的表达则明显升高（图3B）。

图3 LncFTX 调节PPARγ 及其下游基因的表达Fig.3 LncFTX regulates the expression of PPARγ and its downstream genes

2.4 PPARγ 介导了LncFTX 对肠癌细胞的糖酵解干扰LncFTX 后的HT-29 细胞，经10 μmol/L Pioglitazone（PPARγ 特异性激动剂）处理后发现细胞内CS 的含量则由（7.11±0.54）U/mg 变为（4.21±0.27）U/mg，较si-LncFTX 组明显下降（P＜0.05）；而下降的PFK 及LDH 含量均得以有效逆转，分别从（0.10±0.01）U/mg、（61.37 ± 6.70）U/L 升至（0.14 ±0.02）U/mg、（100.83 ± 9.66）U/L，较si-LncFTX 组显著升高（均P＜0.05，图4A）。为进一步验证PPARγ在糖代谢调节中的作用，利用过表达PPARγ 载体转染HT-29 细胞，结果发现PPARγ 能够明显激活PFK和LDH的活性，单纯PPARγ过表达组HT-29细胞内的PFK 和LDH 活性分别为（0.29 ± 0.02）U/mg和（170.43 ± 11.83）U/L，明显高于si-Ctr 组（0.16 ±0.01）U/mg、（109.07 ± 6.70）U/L 和si-LncFTX 组；CS的活性则明显受到抑制［（1.75 ± 0.35）U/mg］，显著低于si-Ctr 组和si-LncFTX 组。但同时转染si-LncFTX 和PPARγ 组细胞中的PFK 和LDH 含量较单纯PPARγ 过表达组仍有所下降，其含量分别是（0.20 ± 0.01）U/mg 和（132.36 ± 11.24）U/L，而CS 含量却有升高［（3.07±0.08）U/mg，图4B］。

WB 实验也发现，通过过表达质粒转染或利用PPARγ 特异性激动剂Pioglitazone 上调HT-29 细胞中PPARγ 表达后明显可逆转LncFTX 对PPARγ 的影响，但其下游蛋白Leptin、TNFα 则出现与PPARγ相反的升高现象。Glut4的表达与细胞中PPARγ表达变化一致，但PDHA1 则在HT-29 细胞si-LncFTX时最高，PPARγ过表达及Pioglitazone 处理后有一定程度的下降（图4C）。这些结果均提示PPARγ 除对下游Leptin、TNFα 有明显影响外，还可调节代谢关键酶的表达参与肠癌细胞的糖耐量代谢过程。

图4 PPARγ 参与LncFTX 对肠癌细胞的糖酵解Fig.4 PPARγ participates in the glycolysis of colon cancer cells induced by LncFTX

3 讨论

LncFTX 作为XCI 区域的非编码RNA 及重要的表观遗传调控因子，参与多种恶性肿瘤的发生进展［11］。本实验的研究结果也显示LncFTX 可作为肠癌的促癌因素而存在，除了促进肠癌细胞的增殖迁移外，还可调节癌细胞的糖酵解过程，改变肿瘤的能量供给，进而调控肿瘤的生长。

PPARγ 作为过氧化物酶体增殖物激活受体家族重要成员之一，PPARγ 还可以通过调控代谢途径促进肿瘤进程，被视为肿瘤治疗的潜在靶点［12］。TEW 等［13］发现，前列腺癌中抑制PPARγ 后，会降低其下游脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）的表达，减缓前列腺癌的发展。在肝癌细胞中，PPARγ的激活能够增加糖酵解水平，最终促进肝癌的发生［14］。本研究结果显示，在肠癌细胞中PPARγ可作为LncFTX 的下游蛋白并受之调控，这与LI等［14］在肝癌中的研究相似，说明LncFTX 能够通过PPARγ 调控不同癌细胞的生长。利用siRNA 下调HT29 细胞中LncFTX 后，除PPARγ 受抑制外，介导葡萄糖转运的Glut4 表达下降，但PDHA1 的表达却明显升高。Glut4 是细胞葡萄糖摄取的重要转运蛋白，其表达异常可致使胃癌糖酵解发生和肿瘤进展［15］，而PDHA1 作为丙酮酸脱氢酶复合体的关键亚基，活性的下降有利于细胞内有氧糖酵解（即Warburg 效应）［16］，而其表达上调则可逆转癌细胞的Warburg 效应［17］。从随后对细胞内CS 及PFK、LDH 的活性和含量分析来看，LncFTX 通过PPARγ调节肠癌细胞的有氧糖酵解过程在过表达PPARγ或利用PPARγ 激动剂后得到部分逆转，也证实了PPARγ 在介导LncFTX 对肠癌糖酵解过程中的重要作用。

Leptin 作为PPARγ 下游的脂性因子，可反映细胞对胰岛素抵抗的敏感性，而TNFα 则在脂肪因子诱导的细胞炎性反应中起重要作用，两者均受PPARγ 的负调控［18］。在本实验中，HT-29 细胞中的LncFTX 表达被下调后，作为下游的Leptin 和TNFα 随着PPARγ 的抑制而升高，该现象在过表达PPARγ 后即被有效逆转，提示LncFTX 还有可能通过PPARγ 影响癌细胞的脂肪代谢过程。

LncFTX 对癌细胞生物学行为的调节多是通过海绵吸附不同miRNA 调控细胞内靶基因的表达而得以实现［7-9］，本研究中LncFTX 对PPARγ 调控的分子机制是否涉及miRNA 的参与尚不清楚。本研究通过核苷酸序列比对分析发现LncFTX 与PPARγ 之间存在一定的互补结合序列的结果来看，LncFTX还有可能直接与mRNA 结合影响PPARγ的翻译过程。但LncFTX 对PPARγ 的影响究竟是直接与其mRNA 作用还是通过某些miRNAs 实现的，有待后续进一步的研究证实。