基于电子舌技术与人工口尝评价相结合的银杏叶提取物掩味技术研究

薛婉莹，李红鑫，吴婧楠，孙常胜，李思潼，马宏瑞，陈晓娇，孙腾跃，郭杏梅，蔡程科*，王洪飞*（.北京中医药大学中药学院，北京 0488；.北京量子高科制药科技有限公司，北京 000）

中药的成分极其复杂，包括生物碱类、黄酮类、内酯类、苦味肽类、糖苷类、萜类等成分，因成分复杂，异常苦涩，所以口感一直不太能被患者接受，找到能使中药苦度降至大家普遍能接受的方法显得尤为重要[1]。银杏叶作为传统中药，具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂等作用[2]。现代医学发现银杏叶提取物及其制剂对于治疗心脑血管疾病[3]、阿尔茨海默病[4]和糖尿病肾病[5-6]等疾病具有显著效果。

银杏叶为银杏科银杏（白果树、公孙树）Ginkgo bilobaL.的干燥叶。一般为人工栽培，秋季叶尚绿时采收，及时干燥。银杏叶中含有丰富的黄酮苷类、萜类、生物碱类化合物，这些成分使得银杏叶提取物的药用价值和适用范围十分广泛。但其味道异常苦涩，大大降低了患者的服用适应性，尤其是儿童，其味道可能会导致呕吐等。所以对银杏叶提取物进行掩味是非常有必要的。一般情况下，传统的掩味方式分为以下几种：一种是通过添加掩味剂如高效甜味剂、香精等造成大脑对味觉的混淆，从而对苦味的敏感度降低；另外一种则是通过对制剂进行处理如包衣，制成微囊等降低与味蕾接触的药量或药物浓度，用于延缓或阻止药物在口腔内的溶解[7]。通常来说添加掩味剂是最常用和最简单的掩盖苦味的方法。通过前期的文献调查发现，纽甜、甜菊苷、阿斯巴甜等甜味剂能抑制盐酸小檗碱、黄酮类、生物碱的苦味[8-10]。

甜味物质包含的化合物有很多，且具有各式各样的化学结构，例如糖（蔗糖、葡萄糖），糖醇（山梨醇、甘露醇、木糖醇），肽（阿斯巴甜），蛋白质（单胞素）。甜味剂的效力被定义为蔗糖浓度与甜味剂浓度的比值。如蔗糖和葡萄糖被称为低效价甜味剂，其甜味剂的效力约为1或更少（0.6～0.7）。另一方面，甜味剂效力超过10的甜味剂被称为高效甜味剂，如纽甜、三氯蔗糖和阿斯巴甜。对于一些低效价甜味剂，如蔗糖和木糖醇，甜味强度随着浓度的增加而增加。即使同样的效果在低浓度的高效甜味剂时也会发生，但在高浓度的高效甜味剂下，甜味强度的增加会放缓至趋于稳定。由于这些特性，低效甜味剂（如甘露醇和山梨醇）和高效甜味剂（如阿斯巴甜和糖精钠）通常一起用于药物中，以补充甜味度和改善饮用口感。本研究选择了阿斯巴甜和纽甜、甜菊苷、三氯蔗糖这四种甜味剂，利用口尝法和电子舌法探究其对银杏叶提取物的掩味效果，并总结相应的规律，为今后的中药掩味奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

SA-402B型电子舌（日本Insent公司）；CP225D型电子天平（十万分之一，精度：0.01 mg，德国Sartorius 公司）；JOYN-SXT-02型索氏提取器（上海乔跃电子科技有限公司）；ADS-800型吸附树脂（科海司北京科技有限公司）；HHS型电热恒温水浴锅（上海百典仪器设备有限公司）。

1.2 试药

阿斯巴甜（北京维多化工有限公司，批号：20210424）；纽甜（深圳佳加甜味剂有限公司，批号：20210107）；三氯蔗糖（江西阿尔法高科制药有限公司，批号：20210301）；甜菊苷（曲阜香州甜菊制品有限责任公司，批号：20201107）；银杏叶：2月采于陕西杨凌，每次采收的银杏叶都及时放入60～70℃的干燥箱中干燥24 h，经北京中医药大学中药制剂系蔡程科教授鉴定均符合2020年版《中国药典》一部项下有关规定要求；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 银杏叶提取物的制备

取约1 kg银杏叶晒干磨成粉，浸于稀乙醇，用索氏提取器加热回流提取，浓缩提取液并回收乙醇。将浓缩提取液用处理后的大孔树脂进行吸附，并用不同浓度梯度的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，进行喷雾干燥，回收乙醇并不断浓缩形成浸膏。最后真空干燥，粉碎形成粉末，制得银杏叶提取物粉末。

2.2 盐酸小檗碱溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱10 g，加水配制成质量浓 度 为0.00、0.01、0.05、0.10、0.50 mg·mL－1的参比液。

2.3 确定苦度评价等级

结合银杏叶的自身特点和查阅文献[11]，确定了苦度值分为五个等级，见表1，取“2.2”项下的盐酸小檗碱溶液（参比液），给志愿者进行预实验，培训如何对药品的苦味进行评价。

表1 苦味评价标准Tab 1 Criteria for bitterness evaluation

2.4 样品制备

2.4.1 阳性参比液的配制 取800 g自制的银杏叶提取物，加水至8 L，充分溶解，过滤后，制得阳性参比液。根据志愿者口尝后的综合评分得阳性参比液的苦度值为5，口感评价为：不能忍受的苦味，且后味非常持久。阳性参比液的苦度值之所以选择5是因为选择3或4的话加入掩味剂之后苦度值的下降并不会非常明显。

2.4.2 含有掩味剂的样品溶液的制备 取“2.4.1”项下方法制备而成的苦味原液16份，每份400 mL，分别加入纽甜：1.25、2.5、3.75、5 mg·mL－1；三氯蔗糖：5、6.25、7.5、8.75 mg·mL－1；阿斯巴甜：5、7.5、10、12.5 mg·mL－1；甜菊苷：5、10、20、25 mg·mL－1，即得。

2.5 志愿者筛选

经北京中医药大学伦理委员会同意审批后，选择20名身体健康的志愿者（10名男性，10名女性），对其进行了严格的苦味敏感度筛查，并签署了知情同意书。

2.6 口尝评价法

2.6.1 评价方法 本实验采用口尝评价＋排序法，这是非常常用的评价苦味的方法。首先要先对阳性参比液即未添加掩味剂的溶液进行口尝法评分。首先取30 mL的阳性参比液置于纸杯中，由志愿者含入口中，从舌尖至舌根充分感受参比制剂的味道维持20 s，吐出后漱口5次，在志愿者充分感知苦味的时候告知其苦度分级及具体的苦度值。漱口后，确定口中完全无苦味的情况下，方可再次测定样品的苦度值。

参照阳性参比液的测试方法，每轮实验给志愿者测试4个样品，按照苦度值从低到高的顺序给样品排序，并结合阳性参比液的苦度值给每个样品一个具体的苦度值，并把志愿者给出的结果记录在药物苦味评分表中。每次志愿者测试完一个样品之后皆要漱口5次，待口中完全没有苦味之后1～2 min才能测试下一样品。每两轮样品中间志愿者休息1 h，并且要保证本实验志愿者测试的样品是随机、单盲的。

2.6.2 异常值的剔除 由于本实验中含有生物样本，且每个受试者之间也会存在个体差异，故导致测试结果中会有异常值。Grubbs检验法用来判断实验误差，并可将测试结果中的异常值剔除。采用双侧检验，显著水平α＝0.05的方式剔除离群值，每一组每一轮仅剔除一个异常值，剔除之后不再进行补充测试。

3 电子舌测定

3.1 SA402B型电子舌简介

SA402B型电子舌（日本Insent公司）是一种类脂膜电位型电子舌，类脂膜由多种电位型电极组成，与人体味蕾细胞的细胞壁脂质膜类似，能够感知区别不同的样品溶液，感知基本的味道，进而辨识不同的物质。

3.2 仪器参数

采用苦味分析系统 BT0、AN0 共 2 个传感器及 1 个标准电极。传感器经活化、校正后测样。见表2。

表2 传感器说明Tab 2 Descriptions of sensor

3.3 电子舌测试程序

3.3.1 样品处理方法 将35 mL样品置于50 mL离心管超声20 min，待充分溶解后测试，将待测样品稀释10倍后取35 mL样品置于电子舌特定样品杯中测试。

3.3.2 SA402B 型电子舌测试 平衡：传感器先在清洗液中清洗90 s，阳性参比液清洗120 s、继续用含有酒石酸的氯化钾溶液（精密称取1.12 g氯化钾和0.024 g酒石酸，溶于250 mL蒸馏水中，充分溶解后置500 mL量瓶中定容）清洗 120 s，传感器在平衡位置归零30 s。

测试：测试时间30 s，输出先味值；后用含有酒石酸的氯化钾溶液清洗3 s，传感器插入新的阳性参比液中测试回味30 s，循环测试4次，去掉第一次循环，取后3次平均数据作为测试结果。

4 结果与讨论

4.1 口尝法评价不同掩味剂对银杏叶的掩味结果

对“2.4.2”项下方法制备的样品进行口尝法测试，通过Grubbs的检验，用t检验评价得到不同浓度不同掩味剂对于银杏叶阳性参比液掩味前后的差别，结果见图1。

图1 不同浓度不同掩味剂的苦度值结果Fig 1 Bitterness of different masking agents at different concentrations

4种掩味剂抑制苦味的效果和浓度变化的趋势是一致的，随着质量浓度逐渐增大，苦度值随之减小。纽甜在质量浓度1.25～5 mg·mL－1时对于银杏叶的掩味效果变化最为显著，三氯蔗糖和阿斯巴甜对银杏叶苦味的掩味效果相当，甜菊苷对银杏叶苦味没有明显的掩味效果。

随着纽甜用量的增多，虽然银杏叶的苦味有明显下降，甜度逐渐上升，在纽甜质量浓度超过3.75 mg·mL－1时，据口尝者反馈，甜度过高，逐渐影响口尝者喜好，其甜苦相间的口感会使得口尝者感到不适。综合苦度值的下降和口尝者的描述，纽甜作用在银杏叶掩味的最佳质量浓度为3.75 mg·mL－1。

对纽甜、三氯蔗糖、甜菊苷和阿斯巴甜的4种浓度对数与苦度降低值进行线性拟合，结果见表3，4种掩味剂在实验浓度下掩味效应与浓度的关系符合韦伯-费希纳定律，这说明感觉强度与浓度的对数是成正比的，银杏叶苦度值的下降与掩味剂的浓度也成正比。

表3 4种掩味剂的苦度降低值与浓度间的关系模型拟合方程Tab 3 Model fitting equation for the relationship between bitterness reduction and concentration of 4 taste masking agents

4.2 电子舌法评价结果

本实验通过对阳性参比液和加入不同浓度掩味剂的样品进行电子舌测试，测得BT0碱基盐类苦味和AN0碱性苦味。

电子舌对阳性参比液的AN0的测试结果为－1.14，说明AN0传感器对于银杏叶的苦味并无响应，加入不同的掩味剂结果也是负数，说明AN0传感器得到的结果不能作为掩味效果的依据。电子舌对阳性参比液的BT0测试结果为6.09，银杏叶和加入不同的掩味剂的样品均对BT0传感器有明显响应，见表4。纽甜和甜菊苷随着浓度的增大苦度值Ie也增大，但对于三氯蔗糖和阿斯巴甜来说随着浓度的增大Ie是减小的。所以本文选择BT0传感器进行研究。纽甜的浓度变化引起的BT0苦味值变化最为剧烈，所以可以初步判断纽甜对于银杏叶的掩味效果最为明显。

表4 各掩味剂BT0碱基盐类苦味结果Tab 4 Bitterness of BT0 base salts of each taste masking agent

5 讨论

人工口尝法得到的结果是纽甜对银杏叶的掩味效果最佳，纽甜有高甜度、无后苦、低热量等优点，并且对多类中药都具有较好的掩味效果，人的感官在分辨力和敏感度等方面均存在个体差异，对于甜度的喜好也各不相同，所以掩味的时候不是甜度越高越好，应当设置一个合理的范围。电子舌是一种新兴的仿生仪器，多应用于食品口感评价[12]和药物味道辨识[13-14]等方面，有关电子舌在评价药物的掩味方面的研究相对较少，尤其是中药，更缺乏相对丰富的理论与技术支持。如同本实验，在结合人的感官评判和电子舌的实验结果后，也发现了一些问题，本实验所选择的掩味剂和阳性参比液都是比较简单的体系，比较容易从电子舌的测试结果中找出规律，但是并不是所有的苦味传感器都能有所响应，考虑AN0传感器不能应答的原因可能与掩味剂及银杏叶的质量浓度或其固有属性如分子结构相关，实验设计掩味剂主要有阻断味蕾，增甜，混淆大脑对苦味感官等抑制苦味的原理，银杏叶溶于水后比较黏，有些物质可能吸附在传感器上，减少了苦味物质与传感器的接触，影响了电势，或者与电子舌本身性质也有关系。综上所述，电子舌仍需进行优化和改进，才能更好地应用于评价药物的掩味效果，单独使用电子舌对类似的制剂进行处方筛选，发挥其客观、快速、稳定、标准的优点。

本实验电子舌和口尝法两种方法各有优缺点，且得到的结果也都具有参考意义，口尝法能够利用得到的数据拟合出方程和曲线，方便我们对掩味剂的浓度对其掩味效果进行预测，而电子舌得出的实验结果与口尝法的结果也有相似之处，但局限于特定的载体和特定的味觉传感器，本实验揭示了4种掩味剂抑制银杏叶苦味的规律，对中药的掩味研究具有一定的参考意义，然而中药的苦味成分非常复杂，本实验所建立的方法仍需要进一步研究。