同位素内标-高效液相色谱-串联质谱法同时测定小麦和玉米中19种真菌毒素

何卓霖，李子琨，穆 蕾，谢云峰，王 亮

(新疆大学生命科学与技术学院1，乌鲁木齐 830046) (北京工业大学环境与生命学部2，北京 100124) (中粮营养健康研究院；营养健康与食品安全北京市重点实验室3 ，北京 102209)

真菌毒素是产毒真菌在一定条件下产生的次级代谢产物，能够引发人和动物产生各种急性或慢性疾病[1-4]。世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)将单端孢霉烯族类毒素、伏马类毒素、赭曲霉类毒素、黄曲霉类毒素等列为造成食源性疾病的根源之一[5,6]。粮食及其制品在生产、加工和运输的过程中均有可能受到多种真菌毒素污染[8,9]。据调查，我国小麦和玉米易受脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和伏马毒素(FB)等的污染；朱群英等[10]利用液质联用同位素内标法测定204份小麦粉样品中7种真菌毒素，其中DON检出率达90%，超标率为41%，ZEN检出率为68.6%，超标率为2.9%；谭莉等[11]利用基质分散固相萃取净化(QuEChERS)技术结合超高效液相色谱-串联质谱法测定240份玉米样品中的9种真菌毒素，DON及其衍生物检出率为30.4%～52.9%，FB检出率达85.8%～96.7%；任贝贝等[12]对河北省的74份玉米、玉米制品以及240份小麦样品中16种真菌毒素污染水平进行调查分析，FB、ZEN和DON为主要污染物。我国高度重视真菌毒素污染问题，颁布了食品中真菌毒素限量标准[13]，对小麦和玉米中黄曲霉毒素B1 、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的含量作了限定，但是尚未明确规定伏马毒素、T-2毒素和HT-2毒素等毒素限量值。开发快速、精准、高通量的真菌毒素检测方法对于加强粮食毒素污染监测能力，提升粮食质量安全保障水平，具有重要意义。

目前，常用的真菌毒素检测方法主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)[14,15]、高效液相色谱法(HPLC)[16-19]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS )[20,21]等。其中ELISA具有方法简单、样品处理时间短等优点，多用于单一真菌毒素的快速检测，但重复性较差且易受到基质的干扰出现假阳性[14]。HPLC法常结合荧光或紫外检测器，多用于检测单一或者同一类化学性质相近的同类真菌毒素，但受限于定性能力不足，无法实现多组分真菌毒素同时快速测定[16-18]。LC-MS/MS法具有强大的定性、定量分析能力，适用于多种类真菌毒素同时检测；其特有的选择性离子监测技术，极大提高了检测的灵敏度和特异性，使得样品可以采用更为简单、快速的预处理[19-22]，结合同位素内标定量方法能够校正质谱离子化过程存在的基质效应，保证分析结果的准确性和稳定性[23,24]。

本研究针对常规真菌毒素繁冗复杂的前处理程序，简化样品提取净化方法, 并利用同位素内标校正样品基质干扰，建立LC-MS/MS法同时测定小麦和玉米中常见19种真菌毒素方法，为粮食中真菌毒素精准检测、污染监测和风险预警提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

LC-30AD高效液相色谱仪，QTRAP 5500 三重四级杆质谱仪，Allegra 64R台式高速离心机，TTL-DCⅡ型氮吹仪，Mili Q超纯水机，Dragon Lab QL902涡旋振荡器，SB-3200DTDN 超声波清洗器。

1.2 材料与试剂

甲醇、乙腈，色谱纯；甲酸，色谱纯；甲酸(98%)；超纯水，Mili Q纯水机制得；黄曲霉毒素混合标准溶液(AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2)；呕吐毒素混合标准溶液(DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON)；T-2毒素(T-2)；HT-2毒素(HT-2)；伏马毒素B1(FB1)；伏马毒素B2 (FB2)；伏马毒素B3 (FB3)；赭曲霉毒素A(OTA)；赭曲霉毒素B (OTB)；杂色曲霉毒素(STC)；玉米赤霉烯酮混合标准溶液(玉米赤霉酮(ZAN)、赤霉烯酮(ZEN)、α-赤霉醇(α-ZAL)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)；13C黄曲霉毒素混合标准液(U-[13C17]-AFTB1、U-[13C17]-AFTB2、U-[13C17]-AFTG1、U-[13C17]-AFTG2)；13C伏马毒素混合标准液(U-[13C34]-FB1、U-[13C34]-FB2)；U-[13C34]-FB3；U-[13C17]-3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-AcDON)；U-[13C15]-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)；U-[13C17]-15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇；U-[13C18]-玉米赤霉烯酮(ZEN)；U-[13C22]-HT-2毒素；U-[13C20]-赭曲霉毒素A(OTA)；U-[13C24]-T-2毒素(T-2)；U-[13C24-STC]；U-[D4-α-ZEL]

1.3 方法

1.3.1 19种真菌毒素混合标准溶液的配制

分别移取一定体积的19种真菌毒素标准溶液于5 mL容量瓶中，加入适量乙腈∶水(80∶20)溶液定容，配制成19种真菌毒素的混合标准溶液，充分混匀后于-20 ℃以下冰箱内避光保存，质量浓度见表1。

表1 19种真菌毒素混合标准溶液质量浓度

1.3.2 16种真菌毒素稳定同位素内标混合标准溶液的配制

分别移取一定体积的16种真菌毒素同位素标准溶液于1 mL容量瓶中，加入适量乙腈∶水(80∶20)溶液定容，充分混匀后于-20 ℃以下冰箱内避光保存，质量浓度见表2。由于ZAN、α-ZAL、OTB 3种毒素无市售商品化内标物质，因此分别选择与其结构类似、出峰相邻的ZEN、α-ZEL、OTA对应的内标13C18-ZEN、D4-α-ZEL、13C20-OTA进行定量。

表2 16种真菌毒素稳定同位素内标混合工作液质量浓度

1.3.3 真菌毒素定量标准曲线工作液的配制

准确吸取2、4、6、8、20、40、80 μL真菌毒素混合标准溶液，均加入10 μL同位素内标混合标准溶液，用甲醇∶水∶甲酸(30∶70∶0.1)溶液稀释成体积为200 μL的19种真菌毒素定量标准曲线系列工作液。

1.3.4 样品前处理

取玉米试样，高速粉碎机粉碎，混匀，准确称取2 g样品(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，加入50 μL的内标混合工作液，加入10 mL乙腈∶水∶甲酸 (80∶18∶2)溶液提取，涡旋振荡1 min，超声提取20 min，在4 ℃下8 000 r/min离心10 min；将上清液转移至另一洁净离心管中，涡旋混匀1 min，取5 mL在40 ℃水浴下氮气吹干，加入500 μL甲醇∶水∶甲酸(30∶70∶0.1)溶液复溶，涡旋震振1 min，超声5 min，12 000 r/min离心10 min，取上层清液待测。

1.3.5 色谱条件

色谱柱：Shiseido-C18(100 mm×2.0 mm×3 μm)，进样量10 μL，流速0.3 mL/min；流动相：A相为0.1%甲酸/水溶液，B相为甲醇溶液，梯度洗脱条件如表3所示。

表3 梯度洗脱程序

1.3.6 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，离子源温度：550 ℃；离子喷雾电压：5 500 V(正模式)/-4 500 V(负模式)；气帘气：35 psi；气体1∶50 psi；气体2∶55 psi；采用多反应监测(MRM)模式进行检测，质谱参数见表4。

表4 质谱条件参数

续表4

2 结果与讨论

2.1 真菌毒素的分离优化

本研究通过优化液相流动相洗脱梯度、质谱离子源参数以及各真菌毒素的碎裂能和去簇电压，以期获得最优的分离效率和检测灵敏，结合19种真菌毒素的结构性质差异，分别使用正、负离子模式采集，MRM色谱图如图1和图2所示。

图1 13种真菌毒素混标的正模式MRM色谱图

图2 6种真菌毒素混标的负模式MRM色谱图

2.2 前处理方法优化

为有效避免粮食基质对真菌毒素提取效率的影响，综合考虑19种真菌毒素的极性差异，分别使用不同有机相比例的提取液进行提取。以玉米基质为例，分别考察使用10 mL乙腈∶水∶甲酸=80∶18∶2的提取液和10 mL乙腈∶甲酸=98∶2提取液提取，本实验中，应用乙腈∶水 (98∶2) 进行提取时，提取液中高比例的有机溶剂会大量溶出基质中的杂质，造成方法灵敏度降低；其次，大部分毒素的回收率也无法满足要求。经过优化，使用乙腈∶水∶甲酸(80∶18∶2) 提取液时，非极性较大的毒素如黄曲霉毒素、镰刀菌属毒素、赭曲霉毒素等均有较好的提取效率，同时，各真菌毒素的回收率均在60%～120%之间，综合考虑，选取乙腈∶水∶甲酸=80∶18∶2的提取液可实现19种真菌毒素的统一前处理并保证各毒素目标物回收率均满足要求。

2.3 基质效应

基质效应主要是由于样品中的内源性组分以及样品处理过程中引入的杂质造成的，在电喷雾离子化模式下，各类真菌毒素的质谱响应强度均易受到基质干扰[25,26]，本实验根据纯溶剂标准曲线和空白基质标准曲线的斜率来判断基质效应的强弱。基质效应按公式计算:C= ( 1-Ss/Sm) ×100%；式中：C为基质效应；Ss为纯溶剂标准曲线斜率，Sm为空白基质配制的标准曲线的斜率。|C| 在20% 以下为较弱基质效应，在20%～50%之间为中等基质效应，50%～100%为之间强基质效应[27]。小麦和玉米的基质效应见表5。结果显示，黄曲霉毒素、呕吐毒素和伏马毒素都具有强基质效应，其余的少数真菌毒素属于较弱基质效应。因此，在所有样品和标品中均加入稳定同位素，利用同位素内标法定量，从而弥补真菌毒素的基质效应，保证质谱结果的稳定性与准确性。

表5 小麦和玉米的基质效应

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线、检出限和定量限

以目标分析物面积与对应内标峰面积的比值为纵坐标(Y)、相应目标分析物的质量浓度为横坐标(X, μg/L)绘制标准曲线，以3倍信噪比和10倍信噪比时对应的目标物峰面积计算浓度，确定方法对于各目标物的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，结果如表6所示。在质量浓度范围内19种真菌毒素色谱峰面积与质量浓度成良好线性关系，相关系数R2大于0.992，检出限(LOD)为0.04～10.00 μg/kg，定量限(LOQ)为0.12～30 μg/kg。

表6 线性方程和检出限、定量限

2.4.2 回收率和精密度

取空白样品，分别添加低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液，每个加标水平平行测定6次，计算6次加标实验的平均回收率以及相对标准偏差(RSD)，结果见表7。本方法回收率和精密度结果良好，回收率在61%～117%之间，相对标准偏差(RSD)小于15%，符合GB/T 27404—2008的实验室质量控制规范要求[28]，方法具有良好的准确和精密度，适用于粮食中19种真菌毒素的日常检测。

表7 回收率和精密度结果(n=6)

续表7

2.4.3 质控样品的考察

为了进一步验证方法的准确性和适用性，使用建立的检测方法对FAPAS能力测试样品玉米标准物质(TCL0406QC)进行检测。如表8所示，10种真菌毒素的检测值均在范围内，且接近标示值，表明本实验所建立的方法准确可靠。

表8 基体标准物质玉米中各真菌毒素检测结果

2.5 实际样品测定

应用建立的方法，对来自不同产地的14份小麦和14份玉米样品进行检测，结果如表6所示。玉米主要受到呕吐毒素、伏马毒素和玉米赤霉烯酮的污染，其中呕吐毒素和玉米赤霉烯酮的检出率均为86%；我国真菌毒素限量标准GB 2761—2017对谷物及其制品中DON和ZEN的限量为1 000、60μg/kg[12]，而样品中DON和ZEN的含量为1 870.25、266.75 μg/kg，严重超过国家限量标准，超标率均为43%；而小麦中主要污染的毒素为15-AC-DON、DON、FB1，小麦中各真菌毒素均未超过国家限量。为确保粮食质量安全，在粮食种植和生产的过程中进行真菌毒素的监测十分有必要。

表9 小麦、玉米实际样品检测结果

3 结论

本研究基于高效液相色谱-串联质谱技术，结合同位素内标定量，建立了小麦和玉米中19种真菌毒素的精准检测方法。该方法灵敏度高、前处理简单、分析速度快。经验证，准确度和精密度满足方法学要求，方法定量限远低于我国国家标准小麦和玉米中真菌毒素最大残留限量标准，适用于批量粮食样品中多种类真菌毒素残留污染的快速筛查和精准定量检测。