免疫亲和高效液相色谱法结合二极管阵列 检测器测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇

◎ 莫秋云，陶剑恒，唐昭领

（贺州市检验检测中心，广西 贺州 542800）

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）又称呕吐毒素，是一种潜在致癌性霉菌毒素，是禾谷镰刀菌侵染谷物时产生的B 型单端孢霉烯族毒素[1-2]。DON 在250 ℃下1 h 以上才能被完全降解[3]。谷类作物在生长、收割、仓储、加工、运输和销售等诸多环节均可能产生霉变，因此DON 广泛存在于受霉菌污染的小麦、大麦、玉米及其加工产品中[4]。DON 可抑制真核生物细胞蛋白质合成，破坏人和动物的免疫系统，既能引起急性中毒，也可造成慢性损害。动物急性中毒主要表现为呕吐、拒食、体质量降低和腹泻，人群DON 急性中毒症状包括恶心、呕吐、胃肠紊乱、头晕、头痛和腹泻，慢性中毒表现为摄食减少、生长缓慢及血清免疫球蛋白水平改变[5-8]。

小麦是全球种植面积最大、总产量最高，也是最为重要的粮食作物，全球有超过1/3 的人口以小麦制品为主食。在中国，小麦仅次于第一大粮食作物水稻，小麦及其制品的质量安全直接关系到中国过半人口的食品安全[9]。我国在《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中明确规定小麦粉中DON 的限量为1 000 µg·kg-1，DON 是粮食检测中十分重要的安全指标[10]。

国家标准中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法主要有4种，同位素稀释液相色谱-串联质谱法、免疫亲和层析净化高效液相色谱法、薄层色谱测定法以及酶联免疫吸附筛查法，适用于小麦粉中DON 的测定主要为免疫亲和层析净化高效液相色谱法[11]。刘霞[12]对《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》（GB 5009.111—2016）中高效液相色谱法测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行了验证，其测试的色谱条件为流动相甲醇-水（20 ∶80，V/V），流速1 mL·min-1，检测波长218 nm，线性和回收较好。姜云晶等[13]对脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行了含量检测，色谱条件为流动相为乙腈-水（16 ∶84，V/V）；流 速0.8 mL·min-1；紫 外 波 长 218 nm。姚霞等[14]比较了免疫亲和柱-高效液相色谱法和免疫亲和柱-液质联用法检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇，液质联用法灵敏度高，检出限低，但在检测有本底样品时容易产生假阳性，成本高，高效液相色谱法更简便、经济、环保。免疫亲和高效液相色谱法结合二极管阵列器定性和定量检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的文献报道较少，何攀等[15]优化了液相色谱条件为流动相为甲醇-水（25 ∶75，V/V），检测波长240 nm、扫描范围190 ～400 nm，研究了定性分析的方法。本文在国家标准方法的基础上，选用特异的呕吐毒素免疫亲和柱净化，高效液相色谱结合二极管阵列检测器测定小麦粉中的DON。本方法前处理简单快速，高回收高灵敏，结合二极管阵列检测器，通过保留时间和光谱扫描定性可实现样品确证。该方法避免了现有标准方法的假阳性，对提高检测分析效率和保障粮食安全有重要参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

小麦粉，市场购买。

1.2 试剂与仪器

甲醇（色谱纯），Fisher 公司；聚乙二醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾和盐酸（分析纯），国药集团；实验室用水为Milli-Q 超纯水；脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品（浓度为200 mg·L-1，标准证书编号为CDAA-S-290023-AB-1 mL），购于上海安谱实验科技股份有限公司（ANPEL）。

1260 液相色谱仪（配有二极管阵列检测器），美国安捷伦公司；BT125D 电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；HM100 刀式研磨仪，北京格瑞德曼仪器有限公司；JJSJ22 圆孔筛，飞穗；S180H 超声波清洗器，德国ELMA；HNDK200-2 氮气吹扫仪，东京理化器械株式会社；ST16R 高速冷冻离心机，赛默飞世尔；移液枪（20 ～200 µL，100 ～1 000 µL），德国艾本德股份有限公司；玻璃纤维滤纸，孔径1.5 µm；0.22 µm水相微孔滤膜；50 mL 聚丙烯具塞刻度离心管；10 mL一次性注射器；真空泵；呕吐毒素免疫亲和柱（3 mL，1 000 ng），美国Romer。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液配制

（1）脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液配制。准确移取适量脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液（200 µg·mL-1），用初始流动相稀释，配制成100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1、750 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的标准系列工作液。

（2）磷酸盐缓冲溶液（以下简称PBS）配制。称取8.00 g 氯化钠、1.20 g 磷酸氢二钠、0.20 g 磷酸二氢钾、0.20 g 氯化钾，用900 mL 水溶解，用盐酸调节pH 至7.0，用水定容至1 000 mL。

（3）甲醇-水溶液（25+75）配制。量取250 mL甲醇加入到750 mL 水中，混匀。

1.3.2 样品前处理

①采样和试样制备。抽取有代表性的样品，用四分法缩减取1 000 g，粉碎后过0.5 mm 孔径的分析筛，混匀，装入自封袋中，密封保存，备用。②提取。称取25 g（准确到0.1g）试样于100 mL 具塞三角瓶中，加入5 g 聚乙二醇，加水100 mL，混匀，置于超声波振荡器超声20 min，以玻璃纤维滤纸过滤，收集滤液，在10 000 r·min-1离心10 min，取上清液备用。③净化。事先将低温下保存的呕吐毒素免疫亲和柱恢复至室温。待免疫亲和柱内原有液体流尽后，准确移取 2.0 mL 上清液，注入注射器中。将真空泵与注射器相连接，调节下滴速度，控制样液以每秒1 滴的流速通过免疫亲和柱，用5 mL PBS 缓冲盐溶液和5 mL 水先后淋洗，流速约为每秒1 ～2 滴，弃去全部流出液，抽干小柱。④洗脱。准确加入2 mL 甲醇洗脱亲和柱，控制每秒1 滴的下滴速度，收集全部洗脱液至试管中，在50 ℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入 1.0 mL 初始流动相，涡旋30 s 溶解残留物，过0.22 µm滤膜以备检测。

1.3.3 液相色谱条件

安捷伦Pursuit C18色谱柱（3.9 mm×150 mm，5 µm，SN：552685）；流动相：甲醇+水（25+75）；流速：0.8 mL·min-1；进样体积：50 µL；柱温：35 ℃；检测波 长：218 nm；光谱扫描范围：210 ～400 nm。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

2.1.1 流动相比例优化

试验分别配制甲醇-水（V∶V）10 ∶90、15 ∶85、 20 ∶80、25 ∶75 和30 ∶70，在280 nm，0.8 mL·min-1流速下对DON 标准溶液进行测定分析。结果表明，随着流动相甲醇（有机相）比率的增大，DON 出峰越快，保留时间越短，但分离度也随之变化。出峰越早，越容易被杂质峰（洗脱液）包裹。在甲醇-水为25 ∶75（V∶V）时，保留时间为4.3 min，分离度最好，一次进样在8 min 内完成。

2.1.2 流动相流速优化

流动相的流速是另一个影响色谱出峰的重要因素。在其他条件不变的情况下，试验分别在流速为 0.6 mL·min-1、0.7 mL·min-1、0.8 mL·min-1、0.9 mL·min-1和1.0 mL·min-1条件下进行DON 标准物质测定。结果表明，流速越低，分离度越好，但DON 出峰慢，日常大批量检测成本高。在流速0.8 mL·min-1时，出峰时间和分离度最优。优化色谱条件后，DON 标准溶液色谱图见图1。

图1 DON 标准色谱图

2.2 前处理条件优化

样品经过优化的提取条件提取后，选用特异的呕吐毒素免疫亲和柱对目标物进行净化，洗脱更完全，柱回收率更高。

2.3 方法的线性范围及检出限

试 验 以 流 动 相 配 制100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1、750 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的DON 标准系列工作液进行测定分析，以峰面积（Y）为纵坐标，进样标准溶液浓度（ng·mL-1）为横坐标（X），绘制回归方程为Y=0.231 753X-6.231 59，线性关系良好，相关系数为0.999 70，结果如图2 所示。取未被DON污染的小麦粉样品，以信噪比为3（S/N=3）的标准溶液浓度加标，计算检出限为36 µg·kg-1。

图2 回归曲线图

2.4 回收率及精密度试验

以未被DON 污染的小麦粉为样品，在200 µg·kg-1、400 µg·kg-1和1 000 µg·kg-13 个水平下进行加标回收试验，每个加标样平行测试6 次，计算回收率和精密度。由表1 可知，样品加标回收率在91.2%～98.0%，精密度为0.73%～3.19%，回收率较高，偏差较小。

表1 不同加标水平回收率和精密度表

2.5 二极管阵列检测器定性

通过二极管阵列检测器对DON 标准溶液进行光谱扫描，扫描范围（210 ～400 nm），DON 最大吸收波长为218 nm，与光谱图库进行比对，特征显著 （图3），通过保留时间和光谱图可以对DON 实现定性分析，实现样品确证。

图3 光谱图库和标准溶液DON 光谱对比图

2.6 实际样品测定

用本方法对市售的10 份小麦粉样品进行检测，没有发现阳性样品。

3 结论

本试验建立了基于特异呕吐毒素免疫亲和柱，高效液液相色谱结合二极管阵列检测器测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法，在国家标准方法基础上，实现了简化前处理操作、提高方法回收率及灵敏度和检测结果定性定量准确性、无需质谱进行确证等目的。该方法的建立是现有标准的极大改进，对政府部门开展相关产品的风险监测和检测部门开展相应的常规分析检测具有重要的参考依据。