川芎改善非酒精性脂肪性肝炎的作用机制

王玉平，龚瑾，李沙沙，章正，杨倩之，单璐琛

（1.暨南大学 附属第一医院 药学部，广东 广州 510630；2.暨南大学 附属第一医院 胃肠外科，广东 广州 510630；3.暨南大学 药学院，广东 广州 510000）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝脏功能障碍的常见病因，目前已成为全球流行疾病，这种疾病可以发展为一种晚期形式，称为非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）［1］。在NAFLD谱系中，NASH发展为纤维化并进展为肝硬化的风险最高［2］，影响约3%～5%的普通人群，NASH预计将成为肝硬化和终末期肝病的主要原因［3］。但目前NASH发病机制的分子基础尚不清楚，也无有效的治疗方法及药物，因此，寻找治疗NASH安全有效的方法和药物至关重要。

川芎（CX）是植物川芎（Ligusticum Chuanxiong Hort.）的干燥根茎，一种非常常见的中药，在中国被广泛应用，始载于《神农本草经》，在《本草纲目》中记载其燥湿、止泻痢、行气开郁，主要用于治疗风冷头痛眩晕、胁痛腹疼、寒痹痉挛、经闭、难产、产后瘀阻块痛、痈疽疮疡等症状［4］。研究认为其主要成分阿魏酸、川芎嗪等，已被发现其具有抗炎、改善血脂、提高血液流动性、抑制血小板聚集和发挥抗氧化活性等作用［5］。虽然川芎被报道具有抗炎、改善血脂等作用，但其对NASH或NAFLD的作用鲜有报道。

探究中药成分对于疾病的主要分子作用机制与信号通路，是目前探索中药方剂药理机制的综合有效的方法。本研究以川芎为研究对象，通过网络药理学的方法，采用多成分、多靶点、多通路的思路挖掘川芎改善NASH的作用机制，为后续研究提供依据。另外，本研究通过拟建立NASH小鼠动物模型，给予模型鼠川芎提取物治疗，观察川芎对NASH的改善效果，为临床药物的开发和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 化合物的筛选与潜在靶点的选取

在中药系统药理学分析平台（TCMSP，https：／／old.tcmsp-e.com／tcmsp.php）进行化合物成分和靶点的筛选，设置Herb name的检索条件下以“川芎”为关键词检索其化学成分，口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为筛选条件对川芎中的有效成分进行筛选。利用pubchem数据平台（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／），搜索SMILES结构后录入Swiss Target Prediction（http：／／www.swisstargetprediction.ch／），进行靶点预测获得化合物作用靶点，通过Uniprot数据库（http：／／www.uniprot.org／）得到上述靶点物种设定为人的基因名。

1.2 NASH相关靶点的选取

利用DisGenet数据库（http：／／www.disgenet.org）以“NASH”，“Nonalcoholic steatohepatitis”，“Non-alcoholic steatohepatitis”为关键词，搜索NASH的疾病靶点，将获得的靶点导出备用。

1.3 川芎改善NASH的核心靶点筛选

将所获得的川芎的潜在靶点与NASH疾病靶点导入Calculate and draw custom Venn diagrams平台（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）绘制韦恩图并获得共有的靶点作为核心靶点，将核心靶点导入String数据库（http：／／string-db.org／）获得PPI蛋白互作相关信息，将上述信息导入Cytoscape 3.8.0软件进行编辑及网络分析，绘制PPI网络图及核心靶点相关性信息。

1.4 “川芎-成分-靶点-NASH”网络的构建

利用Cytoscape软件对川芎、有效成分、核心靶点、NASH的关联关系进行可视化，绘制关联网络。

1.5 GO富集分析和KEGG通路分析

将核心靶点录入到Metascape分析系统中（https：／／metascape.org／gp／index.Html＃／main／step1），将筛选条件设置为“H.sapiens”，分别GO富集分析和KEGG通路分析，并将获得信息导入微生信网（http：／／www.bioinformatics.com.cn／）进行GO富集分析柱状图和KEGG通路分析气泡图的绘制。

1.6 分子对接验证

在PPI网络中选取度值排列前5的蛋白靶点与川芎有效成分度值排列前5的化合物进行分子对接验证。利用PDB数据库（https：／／www.rcsb.org／）下载PPI蛋白互作网络核心蛋白的结构，并Pymol去除其配体和水分子；利用PubChem数据库（http：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）下载川芎核心化合物的sdf文件，用OpenBabel软件将其转化为mol2格式，得到的配体（化合物）及受体（蛋白结构）运用autodock软件进行分子对接，最后用Pymol软件将对接结果绝对值最大的4种组合进行可视化。配体和受体结合的构象越稳定能量越低，产生作用可能性越大。当结合能绝对值大于4.25 kcal／moL时，表示分子与靶点具有一定的结合能力，当结合能绝对值大于5.0 kcal／moL时，表示结合能力较强。

1.7 动物与试剂

C57雄性小鼠，SPF级，（20±2）g，购自浙江维通利华实验动物有限公司，许可证号SCXK（浙）2019-0001。高脂饲料（D12108C）购自美国Research Diets有限公司，其中含40%脂肪和1.25%胆固醇。TC、TG生化分析试剂盒购自南京建成科技有限公司。ALT、AST检测试剂盒和HE染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。高速低温离心机购自Sigma公司。

1.8 动物实验

1.8.1 川芎提取物制备

川芎饮片购自广东和祥制药有限公司，原产地为四川，为道地药材，符合中国药典2015年版一部的相关规定。饮片采用10倍量水煎煮提取2次，每次2 h，水煎浓缩；然后醇沉，第1次醇沉体积分数为60%，4℃冷藏24 h，浓缩；第2次醇沉体积分数为80%，4℃冷藏48 h，浓缩得到样品，再进行大孔树脂分离得到样品。根据川芎提取率计算，稀释成川芎组分质量浓度为1 mg／mL；川芎提取物（chuanxiong total extracts，CTE）给药组50 mg·kg-1·d-1灌胃。

1.8.2 动物造模及取材

试验前小鼠经过1周的适应性喂养，期间小鼠饲喂普通日粮，自由采食饮水。1周后随机将小鼠随机分为以下3组：正常对照组（Ctrl）、NASH模型组（NASH）、川芎提取物给药组（CTE），10只／组，5只／笼饲养，每天更换水瓶，每2 d更换1次垫料。Ctrl组小鼠给予普通饲料，NASH组及CTE组小鼠给予高脂饲料，同时CTE组采用灌胃的方式进行给药，每天给药2次。Ctrl组与NASH 组小鼠给予对应体积的生理盐水。实验持续10周，每周称量并记录小鼠体质量。实验结束后，小鼠禁食12 h，第2天取材。麻醉小鼠后心脏取血，于4℃，3 500 r／min的条件下离心15 min，测定各组小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）含量。同时适量称取小鼠肝脏组织，用组织匀浆机制备肝脏组织匀浆，按照试剂盒说明书操作，检测小鼠肝脏组织中的TG、TC含量。部分小鼠肝脏组织约0.5 cm3固定于10%的甲醛液中，之后组织脱水，行HE染色。本研究通过暨南大学实验动物伦理委员会审批（20210603-01）。

1.9 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行实验数据统计处理。计量资料采用mean±SD表示，3组间比较用One-Way ANOVA方差分析和Student's t检验进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 川芎化合物和潜在靶点的收集

本研究通过对样本数量以及后续数据的研究价值考虑，选择OB≥30%且DL≥0.18作为筛选川芎化学成分的条件。通过TCMSP数据库检索得到川芎化学成分189个，其中符合筛选条件的化学成分7个（有效成分5个，川芎醌、川芎哚未预测到相关靶点），具体信息见表1。通过Swiss Target Prediction数据库搜索上述化合物的关联靶点共计307个，采用UNIPROT数据库将靶点名标准化。

表1 川芎主要活性成分信息Table 1 The main active components information of Chuanxiong

2.2 NASH相关靶点的选取

通过DisGenet数据库以“NASH”，“Nonalcoholic steatohepatitis”，“Non-alcoholic steatohepatitis”为关键词，检索非酒精性脂肪肝炎相关靶点434个。

2.3 川芎改善NASH的核心靶点筛选

绘制川芎改善NASH核心靶点韦恩图，并获得靶点44个（图1）。将核心靶点输入String数据库中，以medium confidence（0.400）为筛选条件，最终获得核心靶点39个，获得川芎改善NASH蛋白互作（PPI）网络图（图2）。将PPI数据导入Cytoscape软件，并按照度值排序获得核心靶点数据（表2）。

图1 核心靶点韦恩图Figure 1 Venn diagram of the core target

图2 蛋白互作网络Figure 2 Protein Interaction（PPI）Network

表2 川芎改善NASH核心靶点信息Table 2 The core target information of Chuanxiong

2.4 川芎改善NASH“药物-成分-靶点-疾病”网络的构建

分别将“药物-成分”、“成分-靶点”、“靶点-疾病”的关联数据导入Cytoscape软件，通过网络将其连接起来，并剔除不相关的靶点，将川芎改善NASH“药物-成分-靶点-疾病”网络关系进行可视化（图3）。

图3 川芎改善NASH网络Figure 3 The network of Chuanxiong improving NASH

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析

川芎治疗NASH的GO富集结果见图4。富集的生物过程包括炎症反应的调节、蛋白质转运的调控、细胞对脂质的反应、蛋白激酶活性的调节、激素水平的调节、对营养水平的反应、类固醇代谢过程、脂质定位的调节等，涉及炎症反应、蛋白质与脂质代谢等生物过程；细胞组成主要涉及细胞膜、囊泡、受体、转录调节复合物、转移酶等；分子功能主要包括了核受体激活、蛋白酶激活、脂肪酸绑定、脂质转运活性等。

图4 川芎改善NASH GO富集分析柱状图Figure 4 GO enrichment analysis histogram

川芎治疗NASH的KEGG通路分析结果见图5，按基因在通路中的比例排序，具体通路信息见表3。川芎治疗NASH与众多通路有关，可能通过调节PPAR 信号通路、AMPK 信号通路、cAMP信号通路、Wnt信号通路等发挥作用。

图5 川芎改善NASH KEGG通路分析气泡图Figure 5 KEGG signaling pathway analysis bubble plot

表3 川芎改善NASH KEGG通路分析Table 3 KEGG signaling pathway analysis

2.6 分子对接验证结果

在PPI网络中选取度值排列前5的蛋白靶点EGFR、ESR1、PPARG、MAPK14、PPARA与川芎有效成分度值排列前 5 的化合物谷甾醇（sitosterol）、杨梅酮（Myricanone）、亚油酸乙酯（Mandenol）、川芎萘呋内酯（wallichilide）、阿魏酸（FA）进行分子对接验证，其 中 PPARG 和Myricanone、PPARA 和 Myricanone、PPARA 和Sitosterol、PPARA和wallichilide的分子对接结果结合能绝对值最高，分别对其进行可视化，具体结构如图6、表4所示。

表4 川芎改善NASH KEGG分子对接信息Table 4 KEGG Molecular Docking Information

图6 川芎改善NASH分子对接图Figure 6 Molecular docking map

2.7 动物实验

2.7.1 一般情况及体质量变化

实验期间3组小鼠饮食及排便基本正常，正常组小鼠反应迅速，动作灵敏，皮毛整洁有光泽；NASH模型组小鼠活动较少，皮毛油腻；CTE给药组一般情况有所缓解，CTE组体质量较NASH组明显下降，但与对照组无显著差异（图7）。

图7 各组体质量曲线图Figure 7 Body mass graph of each group

2.7.2 血清酶学及肝脏脂质水平比较

与正常对照组比较，NASH模型组肝脏组织TC、TG水平，血清ALT、AST均明显升高，有显著差异（P＜0.05）。与CTE组比较，NASH模型组血清ALT、AST，肝脏组织TG水平均明显下降（P＜0.05），但肝脏组织TC水平差异无统计学意义（图8）。

图8 各组小鼠血清酶学及肝脏脂质水平比较Figure 8 Comparison of serum enzymology and liver lipid levels of mice in each group

2.7.3 小鼠肝病理变化

由图9可见正常对照组肝小叶结构完整，肝细胞核形态、大小均一，未见明显异常。NASH模型组肝细胞明显肿胀，水样变性，可见散在或灶性肝细胞气球样变，形成脂肪样空泡，CTE给药组小鼠肝小叶脂肪变程度较模型组明显改善。

图9 各组小鼠肝脏HE染色（×200）Figure 9 HE staining of mouse liver in each group（×200）

3 讨论

NASH是一种以炎性浸润和脂肪变性为主要特征的慢性肝病，其与肥胖、血脂异常、胰岛素抵抗等诸多代谢性致病因素密切相关，又被称为代谢性肝炎［6］。目前药物对NAFLD 患者并存的NASH特别是肝纤维都无肯定的治疗效果［7］。本研究根据文献报道［8］，制备川芎提取物，并建造动物模型，结果表明体质量曲线及血液生化指标显示造模成功，川芎提取物治疗组较NASH模型组血清ALT、AST及肝脏组织TG均有明显改善作用（P＜0.05），并明显减轻小鼠肝小叶脂肪变程度，显示该模型效果明显，成功率较高。

氧化应激所导致的脂质氧化和氧化过程中的系列产物，也是引起NASH肝损伤的主要机制之一［9］。本研究GO富集分析结果发现川芎改善NASH炎症反应与脂质代谢、核受体和蛋白酶激活、脂肪酸绑定、脂质转运活性等相关。据报道，NASH的病理生理学很复杂，主要特征是脂肪变性以及肝细胞损伤和炎症反应，常与2型糖尿病和胰岛素抵抗相关，也可能存在于许多其他内分泌疾病中，例如多囊卵巢综合征、甲状腺功能低下，男性性腺功能低下、生长激素缺乏或糖皮质激素过多［10］；来自NASH患者的肝细胞检查结果发现具有异常的脂质成分，脂质的积累会导致细胞器功能障碍，细胞损伤和死亡以及慢性炎症，推断NASH发病机理和潜在治疗靶标的脂质种类和代谢途径，包括参与脂肪酸和甘油三酸酯合成的酶，生物活性鞘脂和多不饱和衍生的类花生酸，以及亲脂性脂质介体［11］。本研究的KEGG通路富集结果显示，川芎治疗NASH与众多通路有关，可能通过调节PPAR 信号通路、AMPK 信号通路、cAMP信号通路、Wnt信号通路等发挥作用。氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）是在脂质代谢和炎症中起调节作用的核受体，这使得PPARs被认为是一种潜在的治疗NASH的作用靶点［10，12］，一些靶点PPARs激动剂已经被证实对NASH具有治疗作用［13-15］。研究发现NASH相关的肝细胞凋亡被AMPK细胞能量状态的主要传感器所抑制，NASH小鼠AMPK活性降低，而肝脏特异性AMPK敲除（LAKO）小鼠研究表明，AMPK的缺失会加大饮食诱导的NASH病理，包括肝脏损伤、纤维化和细胞死亡（特别是凋亡）的增加［16］；AMPK还被认为可以调控脂肪组织炎症和NASH中的巨噬细胞极化，巨噬细胞中AMPK激活和脂肪酸氧化的增加可能为NASH治疗提供新的途径［17］；肝脏特异性AMPK敲除能够加重小鼠NASH模型中的肝损伤，AMPK磷酸化促凋亡caspase-6蛋白以抑制其活化，从而控制肝细胞凋亡。AMPK活性的抑制缓解了这种抑制作用，使caspase-6在人和小鼠NASH中被激活。AMPK激活或caspase-6抑制，即使在NASH发作后，也能改善肝损伤和纤维化，预示着AMPK可能是NASH治疗的靶点［18］。Wnt信号通路的失调与NASH的发生密切相关，针对Wnt信号通路的调节被作为对抗NASH的潜在手段［19-21］。

分子对接结果表明，川芎改善NASH的过程中，由川芎中多个有效成分和核心靶点共同作用发挥治疗其中Myricanone、Sitosterol、wallichilide是起主要作用的成分，目前文献报道的川芎提取方法，得到的川芎提取物其中主要的部分活性成分［8，22-23］。PPARA和PPARG可能是川芎作用最紧密的靶点，PPARA和PPARG共属于PPAR信号通路，均是脂肪代谢和炎症反应中发挥重要作用的靶点，此结果为川芎改善NASH后续研究提供了理论依据。虽然本研究发现的NASH有关的可能靶点及机制已有文献先后报道，而更深的分子机制及完整通路需进一步验证和证实。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法发现川芎可能主要通过谷甾醇、杨梅酮、亚油酸乙酯、川芎萘呋内酯和阿魏酸5种化合物作用于EGFR、PPARG、PPARA、ESR1、MAPK14等39个核心靶点，调节PPAR、AMPK等信号通路发挥对NASH的治疗作用，并通过动物模型进行验证，为川芎改善NASH后续研究提供了理论依据及初步验证。虽然网络药理学研究手段日趋成熟，数据库信息逐渐完善，但仍需进一步的分子机制研究进行验证，为川芎改善NASH提供现实参考。本研究表明，川芎可以改善高脂饮食所致的小鼠非酒精性脂肪性肝炎，具有一定临床应用可能，值得进一步研究。

作者贡献声明

王玉平：文章构思、统计分析数据，撰写论文；龚瑾：分析数据，修改论文建议；李沙沙：部分作图分析；章正：部分作图分析；杨倩之：部分作图分析；单璐琛：提出研究思路和框架，修改论文。

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突。