GSK-J4对人结肠癌细胞的增殖抑制作用

郑稳稳，李安祺，刘子建，张存龙

（1.暨南大学 药学院，广东 广州 510632；2.深圳市坤健创新药物研究院，广东 深圳 518110；3.清华大学 深圳国际研究生院，广东 深圳 518000）

结直肠癌是一种消化道肿瘤，根据2022年美国癌症协会（American Cancer Society，ACS）的统计，其新发病率处于所有癌症中的前3位，且发病年龄日趋年轻化，严重威胁着人类的健康［1］。表观遗传调控异常作为癌症的重要特征［2］，在癌症的发生发展过程中扮演着重要的角色［3-4］，因此靶向表观遗传靶点是结直肠癌治疗的重要手段。

组蛋白的甲基化修饰是表观遗传调控的重要组成部分，它主要由组蛋白甲基转移酶（histone lysine methyltransferases，HMT）和组蛋白去甲基化酶（histone lysine demethylases，KDM）来执行［5］。JMJD3（Jumonji domain-containing protein 3）也称KDM6B，是组蛋白去甲基化酶KDM6家族的一种亚型，可以特异性催化组蛋白H3上第27位赖氨酸（H3K27）侧链的去甲基化，增强原癌基因的转录并促进癌症的发生发展［6-7］。H3K27上的甲基化水平异常和JMJD3蛋白的表达异常在多种肿瘤细胞中被发现，并在肿瘤的增殖、转移及去分化过程中起促进作用［8-9］。因此，开发JMJD3的小分子抑制剂是相关癌症靶向治疗的可行方案。

现已发现的JMJD家族的抑制剂包括琥珀酸［10］、戊邻酮二酸类［11］、铑金属络合物［12］及黄酮醇类似物［13］等。2012年Kruidenier等［14］报道了JMJD3抑制剂GSK-J1，并改造出细胞膜穿透效率更高的乙酯侧链化合物GSK-J4。现有研究显示，化合物GSK-J4可以有效地抑制JMJD3的活性，并且在儿童脑干神经胶质瘤［15］、急性淋巴细胞白血病［9］、成神经细胞瘤［16］、乳腺癌［17］及肺腺癌［18］等癌症的治疗中发挥了一定的效果。

以上研究表明JMJD3抑制剂GSK-J4对多种癌症有抑制作用，但是其在结直肠癌的研究依然相对欠缺。因此，本文将研究GSK-J4对人结肠癌细胞的抑制作用，对癌细胞的增殖、侵袭、凋亡、细胞周期等进行分析，并通过细胞内相关蛋白水平的检测探讨其中的作用机理。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

细胞：人结肠癌细胞HCT116、DLD-1、SW480、SW620、LoVo和HT-29均购于中国科学院上海细胞库。

药品与试剂：GSK-J4，CAS：1797983-09-5，购于Selleck公司。噻唑蓝（MTT），CAS：298-93-1，购于上海生工生物科技有限公司。Annexin V-FITC／PI Apoptosis Detection Kit（货号：40302ES20）和细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（货号：40301ES100）均购于上海翊圣生物科技有限公司。McCoy's 5a（货号：PM150710）、Ham's F-12K（货号：PM150910）和Leibovitz's L-15（货号：PM151010）培养基，购于武汉普诺赛（Procell）生命科技有限公司。RPMI-1640培养基（货号：10-040-CVRC）购于CORNING公司。胎牛血清（FBS）：购于默克Sigma公司。β-Actin抗体，货号AA128，购于碧云天公司。Histone H3（货号：4499S）、Mono-Methyl-Histone H3（Lys27，货号：84932S）、Di-Methyl-Histone H3（Lys27，货 号：9728S）、Tri-Methyl-Histone H3（Lys27，货号：9733S）、p27 Kip1（货号：2552P）、Cleaved Caspase-7（Asp198，货号：9491S）、Cleaved PARP（Asp214，货号：9541S）抗体均购于Cell Signaling Technology公司。

仪器：DTX880 型多功能检测酶标仪（Beckman Coulter公司）、MoFlo XDP流式细胞仪（Beckman Coulter公司）、BIO-RAD GelDoc XR凝胶成像仪（BIO-RAD公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养

HCT116和HT-29使用McCoy's 5a培养基，DLD-1使用RPMI-1640培养基，LoVo使用Ham's F-12K培养基，以上细胞的培养条件为37℃，CO2浓度为5%。SW480和SW620使用Leibovitz's L-15培养基，条件为37℃，无须补充CO2。所有的培养基中均加入10% FBS使用。

1.2.2 MTT法测定细胞抑制率

将细胞悬液接种于96孔板中，每孔100μL，细胞数为5 000个。过夜培养，向孔板中加入不同浓度的GSK-J4，培养72 h。每孔加入10μL 5 mg／mL的MTT溶液，继续培养4 h。除去培养液，每孔加入100μL DMSO溶解结晶物，在酶标仪490 nm处测量各孔的吸光值。细胞抑制率＝1-（D实验组-D空白组）／（D对照组-D空白组），实验设置3个复孔，并重复3次。

1.2.3 Western Blot实验检测蛋白质表达水平

在对数期细胞的培养基中加入不同浓度的GSK-J4，培养24 h后，裂解细胞并提取总蛋白。使用二辛可宁酸法（BCA）测定蛋白的浓度，并煮沸变性，以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白。将蛋白转膜到硝化纤维膜，以5%脱脂牛奶封闭，之后加入所检测蛋白的抗体（一抗）孵育，TBST洗涤后加入对应的二抗，洗涤后加入显影液，在BIO-RAD GelDoc XR凝胶成像仪上检测并拍照，获得对应蛋白的表达情况。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡

药物处理细胞24 h后，收集（1～5）×105个细胞，用PBS清洗两遍后，加入100μL Binding Buffer及5μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙啶（PI）染液，10～15 min后加入400μL Binding Buffer并进行流式细胞检测。

1.2.5 流式细胞术检测细胞周期

药物处理细胞36 h后，收集（1～10）×105个细胞，用PBS清洗一遍后，在乙醇中固定细胞。用PBS清洗后加入0.5 mL染色缓冲液、10μL碘化丙啶储液及10μL RNase A，37℃孵育0.5 h，通过流式细胞仪进行检测。

1.2.6 克隆形成实验检测细胞增殖

在6孔板中每孔接种约500个细胞，过夜培养，加入药物进行处理，每2 d更换一次培养基，数天后，用PBS洗去培养基，加入福尔马林进行固定，之后加入结晶紫染液染色，清洗干净，晾干并在显微镜下拍照。

1.2.7 Transwell实验检测细胞侵袭

使用8.0μm的Transwell小室，上室接种细胞、无血清培养液及加入GSK-J4，下室加入含血清培养液，培养数天后，用福尔马林固定，结晶紫染色并在显微镜下拍照。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8对实验结果进行分析，组间差异采用两样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSK-J4对人结肠癌细胞的抑制能力

现有的小分子化合物中，GSK-J1（图1A）是最有效的JMJD3抑制剂，其JMJD3半抑制浓度（IC50）约为60 nmol／L，但它存在一个羧酸侧链，增大了化合物的极性，使其无法有效的穿透细胞膜，因而难以发挥活性。通过前药策略，Kruidenier等［14］将GSK-J1的羧酸侧链改造成乙酯侧链，得到了化合物GSK-J4（图1B），这样大大提高了化合物的穿透细胞膜效率，但对JMJD3的IC50从60 nmol／L提升到8.6μmol／L，尽管如此，仍然获得了较好的药物活性［14］。

图1 JMJD3的抑制剂GSK-J1和GSK-J4Figure 1 GSK-J4 and GSK-J1 are JMJD3 inhibitors

本研究使用MTT方法评价GSK-J4对人结肠癌细胞增殖能力的影响。分别用不同浓度梯度的GSK-J4处理细胞72 h，并获得对应的细胞抑制率，进而计算出GSK-J4对结肠癌细胞的IC50。GSK-J4对HCT116、DLD-1、SW480、SW620、LoVo和HT-29的IC50分别为（2.07±0.71）、（1.17±0.21）、（0.71±0.31）、（0.72±0.81）、（4.37±0.43）和（4.57±1.09）μmol／L。说明GSK-J4具有良好的抗结肠癌细胞增殖的能力。下文将选择HCT116和DLD-1两种结肠癌细胞对GSK-J4的抑制作用进行评价。

2.2 GSK-J4对HCT116和DLD-1细胞的克隆形成、侵袭、凋亡及细胞周期的影响

首先，使用细胞克隆形成方法评价HCT116和DLD-1细胞的增殖能力。分别用0.2、0.5、1μmol／L浓度的GSK-J4处理细胞，与对照组相比，随着药物浓度的增加，HCT116和DLD-1细胞的克隆形成能力被逐步抑制（图2A）。随后，使用Transwell侵袭实验评价HCT116和DLD-1的细胞侵袭能力，1或2μmol／L的GSK-J4都能很好地抑制细胞的侵袭（图2B）。

图2 GSK-J4对HCT116和DLD-1细胞克隆、侵袭、凋亡和细胞周期的影响Figure 2 The effect on cell clone，invasion，apoptosis and cell cycle of HCT116 and DLD-1 by GSK-J4

除此之外，流式细胞术可以分析细胞凋亡比例及细胞周期分布。用Annexin V-FITC／PI细胞凋亡检测试剂盒测试细胞的凋亡状态，其中Annexin V-FITC可以将早期凋亡的细胞染色，而PI可以将晚期凋亡的细胞染色。由图2C和2D中可以看到，当加入的GSK-J4浓度增加时，HCT116和DLD-1的凋亡细胞比例在增加，5和10μmol／L的GSK-J4处理后，与未处理组的凋亡细胞比例存在显著差异。另外，以PI对细胞核内的DNA进行染色，并根据染色强度得到细胞内DNA的相对量，进而获得处于不同细胞周期内的细胞比例。图2E和2F中可以看到，在1、2、5 μmol／L浓度下，S期的细胞比例在不断增加，GSK-J4处理后与未处理组相比，S期细胞所占比例存在明显差异。

2.3 GSK-J4对HCT116和DLD-1细胞内蛋白质表达的影响

GSK-J4可以抑制HCT116和DLD-1细胞的生长，但相关的分子机理仍不清楚。使用0.5、2、10μmol／L的GSK-J4处理HCT116和DLD-1细胞24 h后，以蛋白免疫印迹实验评价细胞内相关蛋白质表达情况，并以β-actin作为内参（图3）。其中Histone H3为细胞内包含甲基化和非甲基化的总组蛋白H3水平，而Mono-Methyl-Histone H3（Lys27）、Di-Methyl-Histone H3（Lys27）和Tri-Methyl-Histone H3（Lys27）分别代表组蛋白H3的27位赖氨酸（Lys）被修饰1个、2个和3个甲基基团。通过检测组蛋白H3上27位Lys甲基化的水平，发现随着药物浓度的增加，组蛋白H3K27上单甲基化和二甲基化的水平无明显变化，三甲基化的比例有所增加。

图3 GSK-J4对HCT116和DLD-1细胞蛋白质表达的影响Figure 3 The effect on proteins expression in HCT116 and DLD-1 cell by GSK-J4

Caspase-7是细胞凋亡的主要执行者之一［19］，裂解后形成Cleaved Caspase-7成熟亚基，并裂解下游底物［20］，其中就包括PARP，因此Cleaved PARP也是细胞凋亡的标志［21］。图3显示，随着GSK-J4浓度的增加，检测到Cleaved Caspase-7和Cleaved PARP的表达出现上调，说明GSK-J4通过内源性途径诱导了HCT116和DLD-1细胞的凋亡。p27 Kip1是一种周期依赖性激酶抑制蛋白，可强化细胞周期的抑制［22-23］，p27 Kip1的上调（图3）与前面S期细胞周期阻滞一致，说明GSK-J4抑制了HCT116和DLD-1细胞的无限增殖能力。

3 讨论

癌症是一种多基因疾病，现有研究认为表观遗传调控的异常与癌症的发生发展密切相关。其中JMJD3催化的组蛋白27位赖氨酸的去甲基化异常在多种癌症细胞中被发现，并促进癌症的发展和恶化。本文针对JMJD3靶向抑制剂GSK-J4影响多种结直肠癌细胞的增殖、侵袭迁移、凋亡和细胞周期进行研究，结果显示GSK-J4对结直肠癌细胞有显著的抑制作用。使用GSK-J4处理多种结肠癌细胞后发现，GSK-J4可有效抑制肿瘤细胞的生长，其72 h的IC50在0～5μmol／L级别；克隆形成和细胞侵袭实验表明 GSK-J4 可抑制HCT116和DLD-1细胞的增殖和侵袭；进一步研究发现，GSK-J4可降低HCT116和DLD-1细胞H3K27me3的水平。GSK-J4通过上调细胞周期相关蛋白p27 Kip1的表达，使细胞阻滞在S期，抑制HCT116和DLD-1增殖。HCT116和DLD-1的凋亡执行蛋白Cleaved Caspase-7和凋亡标志物Cleaved PARP也出现上调，证明GSK-J4是通过内源性途径诱导了细胞的凋亡。

JMJD3对于不同肿瘤、同一肿瘤不同细胞的作用可能存在差异，本研究仅针对部分结肠癌细胞，对其他种类的肠癌细胞的增殖抑制作用仍有待研究。并且本研究仅在体外细胞水平进行了评价，进一步的体内研究也是必要的。

作者贡献声明

郑稳稳：设计实验、开展实验，统计分析数据，撰写论文；李安祺：共同开展实验，撰写论文；刘子建：提出研究思路和框架，指导实验，修改论文；张存龙：提出研究思路和框架，修改论文。

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突。