环介导等温扩增技术与传统培养技术在下呼吸道病原体检测的应用比较

孙胜君 邢钰馨

1 烟台市烟台山医院检验科 山东 烟台 264000； 2 滨州医学院公共卫生管理学院 山东 烟台 264003

肺部感染的病原体在发达国家以病毒为主，而在发展中国家则以细菌为主[1]。当前，细菌培养法是临床上细菌感染主要的病原学诊断方法，但存在检测周期长、培养菌检出率低、细菌死亡无法检测等缺点[2]。所以，目前临床上急需能够特异、快速检测感染细菌的方法。和传统的PCR核酸扩增技术相比，环介导等温扩增(isothermal amplification，LAMP)技术有特异性更强、敏感性更高、恒温且扩增效率高、操作简便快速等优点[3]。本研究通过在细菌和非典型病原体检测中应用LAMP 技术，旨在比较分析LAMP法与细菌培养法在下呼吸道病原体感染诊断中的差异。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019年12月至2020年4月在我院儿科和呼吸科确诊的肺部感染住院患者152例，均在住院早期同时做肺泡灌洗液LAMP核酸检测和病原体培养。其中，63例来自儿科，89例来自呼吸科。男77例，女75例，平均年龄为(41.9±5.4)岁。

1.2 培养方法

1.2.1 仪器与试剂 Phoenix100全自动细菌分析仪购自美国BD公司，恒温扩增微流控芯片核酸分析仪RTisochip-A购自博奥生物有限公司。所用培养基购自英国oxoid公司，鉴定板条购自美国BD公司，晶芯恒温扩增芯片和晶芯核酸提取试剂购自博奥生物有限公司。

1.2.2 支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)标本采集 应用纤维支气管镜对患者进行常规检查，在患者知情同意的基础上再进行肺部活检和刷检。在活检和刷检前，先对患者实施支气管肺泡灌洗操作，立即将BALF标本转移至无菌培养瓶内，送至实验室进行标本制备。

1.2.3 微生物鉴定 BALF标本采集2 h内分别接种于血平板、巧克力平板和肠道培养基。血平板和肠道培养基置于35℃恒温培养箱中孵育24 h，巧克力平板置于35℃ CO2培养箱中孵育24 h。先挑取优势菌落分纯并培养24 h，再使用美国BD公司Phoenix100全自动细菌分析仪对分纯后的细菌进行细菌鉴定。

1.2.4 LAMP核酸检测 提取BALF标本中病原体核酸后，取20 μL恒温扩增试剂加入34.5 μL提取核酸标本，震荡混匀，加入基因芯片中封口，6 000 r/min离心30 s，置于晶芯Rtisochip-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪中在65℃反应50 min，然后自动测定归一化曲线。

1.2.5 LAMP结果判定 扩增曲线为“S”型曲线为阳性，水平直线为阴性，起峰时间较长且扩增曲线不规则也判定为阴性，归一化曲线显示阴性对照为阴性，阳性对照为阳性。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。两两配对定性资料的比较应用McNemar检验(或校正的McNemar检验)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法检出率的比较 152例标本使用LAMP法检出细菌感染89例(阳性率为58.55%)，共计包含106个菌株，其中混合感染13例。使用细菌培养法检出细菌感染55例(阳性率为36.18%)，共计包含60个菌株，其中混合感染5例。两种检测方法的病原菌检出率比较，P<0.05(表1)。

表1 BALF的 LAMP法与培养法检测结果的比较

2.2 两种方法检出病原体分布情况的比较 使用LAMP法病原体检出率排在前3位的依次为肺炎链球菌(15.79%，24/152)、流感嗜血杆菌(14.47%，22/152)、肺炎支原体(13.82%，21/152)。使用培养法病原体检出率排在前3位的依次为肺炎链球菌(7.89%，12/152)、铜绿假单胞杆菌(5.92%，9/152)、金黄色葡萄球菌(4.61%，7/152)。培养法对病原体检出率低于LAMP法，仅检出了肺炎链球菌和少量流感嗜血杆菌，P均<0.05(表2、3)。两种方法对于培养条件要求不高的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的检出率基本一致(表4、5)，对于肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽假单胞菌的检出率完全一致。这说明，两种检测方法对培养条件要求不高的细菌的检出率差异无统计学意义。LAMP法能检测非典型病原体例如肺炎支原体(13.82%、21/152)和肺炎衣原体(0.66%、1/152)，而培养法不能检出非典型病原体。LAMP法检测出6例耐甲氧西林葡萄球菌，其中有2例是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，而培养法检仅测出2例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(表6)。培养法将凝固酶阴性葡萄球菌作为污染菌处理，并未进行鉴定和耐药性检测，会漏检一些耐甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌。

表2 LAMP法与培养法对于肺炎链球菌检测结果的比较

表3 LAMP法与培养法对于流感嗜血杆菌检测结果的比较

表4 LAMP法与培养法对于金黄色葡萄球菌检测结果的比较

表5 LAMP法与培养法对于大肠埃希菌检测结果的比较

表6 LAMP法与培养法对于耐甲氧西林葡萄球菌检测结果的比较

2.3 两种方法混合感染检出率的比较 本研究将检出两种以上病原菌感染判定为混合感染，检出一种病原菌判定为阴性，进行混合感染分析。两种方法混合感染的检出率比较，P<0.05(表7)。这说明，这两种方法对于混合感染检出率的差异有统计学意义，LAMP法检测混合感染的能力高于培养法。

表7 入院首次BALF混合感染结果比较

3 讨论

LAMP 技术作为一种新的下呼吸道病原体感染诊断手段，敏感性、特异性高，操作简单、快速[4]，可以在临床检测中广泛使用进行病原体鉴定，检测对象包含最为常见的病原体。由于下呼吸道苛养菌在转运过程中容易死亡，对培养基营养和环境要求高，并且使用的抗菌药物容易抑制苛养菌的生长[5]，所以LAMP 法较之培养法在下呼吸道苛养菌的检测方面显现出非常明显的优势，对于苛养菌的检出率远远高于传统培养法。

在混合感染中，培养法较之LAMP法少检出的病原体主要为肺炎支原体、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌。流感嗜血杆菌和肺炎链球菌在体内并无相互抑制作用，但当流感嗜血杆菌和肺炎链球菌同时在体外培养时，肺炎链球菌可以抑制流感嗜血杆菌杆菌的生长[6]，所以LAMP 法对于混合感染的检出率较高，有效避免了传统培养法中优势菌、易于生长细菌对其他菌种的抑制作用。

在LAMP法中增加耐甲氧西林葡萄球菌基因测定，这对于指导医生用药有非常重要的意义。LAMP 法可以在早期明确病原体，有利于规范合理使用抗生素，缩短住院时间，节约医疗资源，特别是对于起病急、病程重的患者来说能有效降低死亡率。但LAMP 法当前仅能检测出芯片中设定的13种病原体，对于病毒、真菌和少见条件致病细菌感染仍然无法检测，仍需其他检测手段作为后续补充，这也限制了LAMP 法的应用范围。