亚砷酸钠对NE-4C细胞增殖、迁移及凋亡的影响

申晨晨 熊昊杰 马 艳

砷是存在于地壳中的有毒类金属元素，广泛分布于自然界中，是一种环境毒物和致癌物。长期砷暴露会导致皮肤、肝脏、膀胱、肾脏和肺部癌症以及心血管系统和神经组织的病变。大量文献已证实无机砷是一种神经毒物，可导致人或动物行为改变，神经系统发育异常，神经元形态学变化、凋亡和坏死等。神经细胞不易再生且对有毒物质十分敏感，因此砷对神经系统的毒性研究尤为重要。神经干细胞的增殖和分化与神经发育密切相关，砷作为一种神经毒物会如何影响神经干细胞的增殖、迁移与凋亡目前还不清楚。本研究通过观察NaAsO对小鼠神经干细胞(NE-4C细胞)增殖、迁移、凋亡及活性氧生成水平的影响，探讨砷导致神经干细胞损伤的可能作用机制。

材料与方法

1.细胞株：小鼠神经干细胞(NE-4C细胞)购自广州吉妮欧公司。

2.试剂与仪器：胎牛血清(FBS)、MEM培养基、青霉素-链霉素混合液、PBS缓冲液和0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司；谷氨酰胺购自以色列BI公司；亚砷酸钠(NaAsO，分析纯)购自北京化学试剂三厂；CCK-8试剂、Hoechst 33342染色试剂、细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、结晶紫、GAPDH购自北京索莱宝公司；caspase-12购自英国Abcam公司；葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、anti-rabbit IgG-HRP购自美国CST公司。高速离心机购自美国Sigma公司；荧光倒置显微镜购自中国麦克迪奥公司；超净工作台、酶标仪购自美国Thermo公司；激光共聚焦显微镜购自日本Nikon公司；电泳仪购自美国Bio-Rad公司；化学发光凝胶成像仪购自美国Protein Simple公司。

3.细胞培养及分组：NE-4C细胞于高糖MEM培养基(含10%FBS、1%青霉素-链霉素、1%谷氨酰胺)，37℃、5%CO培养箱中培养。取对数生长期NE-4C细胞开展实验，分为对照组及NaAsO处理组，其中NaAsO处理组分别用0.4、0.8、1.6、2.4、3.2μmol/L NaAsO处理，细胞计数后取合适密度进行铺板，细胞贴壁后NaAsO干预，活性氧指标干预6h，其余实验干预24h进行后续实验。

4.CCK-8法检测细胞增殖指标：取干预后96孔板细胞，每孔加入10μl CCK-8试剂于培养箱中孵育2h，用酶标仪在450nm处检测各孔的值。抑制率(%)=1-(实验组值-空白组值)/(对照组值-空白组值)×100%。

5.Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力：取干预后Transwell小室，4%多聚甲醛固定20min，1%结晶紫染色20min，PBS漂洗后棉签去除小室内细胞，倒置显微镜下拍照、计数。

6.Hoechst 33342荧光染色法检测细胞凋亡：取干预后6孔板细胞，每孔加入1ml的Hoechst 33342稀释液(10μg/ml)染色20min，于倒置荧光显微镜下观察细胞核形态学改变；出现细胞核体积缩小、固缩、染色质浓缩或凋亡小体形成则判断为凋亡细胞。

7.DCFH-DA活性氧荧光探针检测细胞内活性氧水平：取干预后NE-4C细胞，按照说明书进行荧光探针的装载以及细胞核染色，共聚焦显微镜下拍照，图片采用Image J处理，以荧光强度代表活性氧含量。

8.Western blot法检测细胞内蛋白表达水平：取干预后细胞，裂解液冰上裂解30min，取上清蛋白定量及变性，根据蛋白相对分子质量配置凝胶，样品按照等体积等浓度上样，电泳、电转，5%脱脂奶粉封闭2h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h，洗膜后ECL发光试剂显影，采用Image J对条带灰度值进行分析。

结 果

1.NaAsO对NE-4C细胞增殖的影响：CCK-8实验结果显示，NaAsO对NE-4C细胞的抑制率随药物浓度的增加逐渐增加，经过GraphPad分析，NaAsO对NE-4C细胞的 IC为1.786μmol/L，因此NaAsO处理组定为0.4、0.8、1.6、2.4、3.2μmol/L。NaAsO干预24h后，细胞抑制率随NaAsO浓度升高而升高(=321.6，<0.05，图1)。

2.NaAsO对NE-4C细胞迁移的影响：Transwell细胞迁移实验结果显示了NE-4C细胞在NaAsO作用下迁移能力的变化。如图所示，NaAsO处理后，NE-4C细胞的迁移能力呈下降趋势，表现为穿过Transwell小室的细胞随着NaAsO浓度的升高数量逐渐减少，2.4及3.2μmol/L NaAsO处理组几乎没有细胞穿过小室(=128.2，<0.05，图2)。

3.NaAsO对NE-4C细胞凋亡的影响：倒置荧光显微镜下观察到Hoechst 33342染色后，对照组的NE-4C细胞染色均匀，细胞核轮廓清晰，呈弱蓝色荧光，染色质浓缩现象不明显；处理组细胞核呈亮蓝色荧光，且随着NaAsO浓度增加，各组的亮蓝色荧光逐渐增多，染色质浓缩现象加重，其中3.2μmol/L组由于细胞贴壁能力下降，细胞的数量减少，但染色质浓缩最严重，荧光强度最为明显，详见图3。

4.NaAsO对细胞内活性氧(ROS)水平的影响：用平均荧光强度表示各组细胞的ROS水平，结果发现，0.4、0.8μmol/L组细胞ROS水平与对照组比较，差异无统计学意义，之后随NaAsO浓度的升高细胞内ROS的荧光强度逐渐升高(=57.557，<0.05，图4)。

5.NaAsO对内质网应激相关蛋白的影响：Western blot法检测NaAsO对NE-4C细胞内质网应激相关蛋白表达的影响，结果显示，0.4、0.8、1.6μmol/L组GRP78蛋白表达未见明显变化，2.4及3.2μmol/L组表达水平升高(=12.484，<0.05，图5B)；caspase-12蛋白表达水平从1.6μmol/L组开始逐渐升高(=26.283，<0.05，图5C)；CHOP蛋白表达水平随干预浓度升高而升高，差异有统计学意义(=18.969，<0.05，图5D)。

讨 论

越来越多的动物和人群研究证据表明，砷暴露与神经发育毒性、神经系统并发症和认知发展、学习和记忆损害等方面有关。砷可以通过血-脑脊液屏障，在大脑皮质、海马区和基底核等结构中产生的神经毒性；砷也可通过胎盘屏障，直接影响胚胎期大脑的发育。研究发现神经系统的发育会被砷影响，可引起神经元细胞、星胶质细胞等神经细胞死亡，但砷对神经干细胞的毒性损伤作用研究较少，本研究从细胞水平探讨NaAsO对神经发育损伤的影响。CCK-8法检测发现与其他神经细胞比较，NE-4C细胞对NaAsO的毒性作用更敏感，NaAsO对SH-SY5Y细胞的IC为50μmol/L，对PC12细胞活力造成损伤的最低浓度为40μmol/L，而NaAsO对NE-4C细胞的 IC为1.786μmol/L。较低浓度的NaAsO就会对细胞造成毒性损伤，影响细胞的增殖和迁移能力，使凋亡细胞增多。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)作为细胞内的第二信使可调节许多信号分子，细胞增殖、凋亡、转化、衰老等过程的信号通路都可被其影响。正常情况下细胞内ROS的产生与清除是动态平衡的，当ROS产出大于清除时细胞发现氧化应激，Ca平衡失调和氧化应激是诱发内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)的重要因素。Wang等研究发现,砷干预后细胞内ROS水平明显上升，而加入抗氧化剂则可降低ROS水平，使细胞凋亡率下降。ROS可引发ERS，持续的ERS可激活相应的凋亡因子引起细胞凋亡。本研究中，NaAsO干预细胞6h后即可检测到ROS水平变化，说明ROS的产生是细胞凋亡发生的早期事件。

引起细胞凋亡的3种途径中，内质网应激途径较受关注。内质网应激是通过错误折叠或未折叠的蛋白质在内质网的管腔中堆积来表达的，此外，蛋白质合成过多、钙蓄积、氧化应激、营养缺乏和感染等都会导致内质网应激。轻度ERS对细胞损伤具有保护作用，持续的ERS可导致细胞死亡。GRP78广泛分布于内质网中，是ERS的标志性蛋白，其表达水平能够反映出ERS的发生、发展。

CHOP是介导ERS诱导细胞凋亡的特异性转录因子，在正常情况下低表达，当ERS时很多信号通路都可诱导CHOP使其表达量增加，参与到下游细胞凋亡途径。caspase-12是内质网特异性的凋亡效应蛋白，当其被激活时可进一步激活凋亡执行蛋白caspase-3，导致细胞凋亡。Lu等研究发现，AsO可导致脑神经瘤细胞(neuro-2a)发生凋亡，使ERS相关分子(GRP78、XBP-1和CHOP) 蛋白以及基因水平的表达上调；有研究发现,NaAsO作用于SH-SY5Y细胞时可使细胞GRP78、CHOP等蛋白的表达水平上调。本研究同样发现，NaAsO可使NE-4C细胞内GRP78、caspase-12、CHOP蛋白表达水平上调，意味着NaAsO可引起NE-4C细胞内质网应激。

综上所述，本研究初步发现NE-4C细胞对NaAsO较为敏感，较低浓度就可抑制细胞增殖迁移，诱导细胞凋亡，上述实验结果表明细胞凋亡可能是由于ROS水平增高引起细胞内质网应激诱导的，但内质网应激诱导细胞凋亡的信号机制还需要进一步研究。