基于比色检测的通用型分析仪设计

刘淦楠，朱桂贤*，王 旭，徐友春

（1.北京信息科技大学 仪器科学与光电工程学院，北京 100096；2.清华大学 医学院，北京 100084）

即时检测（Point-of-care testing，POCT）[1]设备对实验室基础设施的依赖程度较低，具有检测快速、操作简单和无须专业操作人员的优势，可在中心实验室以外使用[2-3]。现有POCT 装置获得最终结果所采用的信号检测方法包括比色检测、荧光检测、化学发光检测、光电化学发光检测和光谱检测等[4-6]。在这些检测方法中，比色检测最为简单、实用，应用也最为普遍，因为其很大程度上可由用户直接肉眼判断结果，如早早孕检测试纸条等，而其他检测方法通常会涉及到较复杂或昂贵的外接设备，即时检测的实用性不够[7]。

在比色检测的装置中，纸基微流控分析装置（Paper-based microfluidic analytical devices，μPAD）即较为常见的试纸条，是最被广泛采用的方案，其具有检测结果可视化、检测效率快、可在偏远地区应用、操作简单和稳定性强等优势。比色检测的最基本原理是待检组分会跟底物反应产生有颜色的物质或颜色的变化，根据颜色深浅即可反推出待检组分的浓度，实现半定量或定量检测[8-10]。在需要对结果进行半定量或定量分析时，肉眼识别带来的误差就较为显著，在这类应用中，将比色反应的结果数字化很有必要。因此，当前的μPADs 比色检测方法中检测结果均由数字化器件获得，如扫描仪[11]、手机摄像头[12-13]或分立的CMOS 摄像头，最终结果传输到PC 或手机端分析展示。例如，Hou等[11]开发了一种基于比色检测的WIFI扫描仪用来定量检测血浆中葡萄糖浓度含量；成亚倩等[14]介绍了基于比色生物检测技术在食品黄曲霉毒素（AFT）检测中的研究进展。

然而，现有基于比色检测的POCT 系统往往都是专门设计的，无论是检测单个指标[15]还是实现对同一检测物中的多指标检测[16]，仪器的通用性不够。不同试纸条配套的检测仪器不能互换。随着POCT 检测需求的不断发展，积累的检测装置也不断增加，对于资源效率的占用变大。如何开发一款通用型的分析仪，能适配多数基于比色法试纸条的即时检测，成为一个需要研究人员发挥智慧来回答的命题。

本论文中提出了一种基于CMOS 摄像头成像利用试纸条适配器来指征待检试纸条基本信息的通用型比色分析仪，并将其应用于2 种典型的生化、免疫试纸条的检测中，即葡萄糖试纸条的半定量生化检测和肠毒素的定性免疫检测。该系统的核心是纸基检测条的适配器和基于树莓派控制板的小型便携式检测盒。用户将检测条插入检测盒中，树莓派摄像头会拍摄试纸条，并根据适配器携带的基本信息确定检测指标是什么，检测区域在哪儿及定量的标准曲线。适配器中含有线圈，其被提前写入对应的纸基检测条或直接称呼为试纸条的所有必要参数，插入分析仪时可被近场通信（Near Field Communication，简称NFC）模块无线感应。利用该适配器来确定检测对象和摄像头采集比色反应的RGB 值，是实现通用型生化、免疫检测的关键。血糖和肠毒素检测试纸条的验证实验证明了以上方案的可行性。

1 实验

1.1 材料和试剂

金黄色葡萄球菌肠毒素检测盒（胶体金法）购自北京美正生物科技有限公司（中国北京），血糖试纸（葡萄糖脱氢酶法）和罗氏血糖仪购自罗氏诊断产品（上海）有限公司（中国上海），质控血清购自RANDOX（Britain），所有溶液均使用磷酸缓冲盐溶液（PBS）（0.1 M）制备。

1.2 葡萄糖比色法检测

目前，葡萄糖、蛋白质、pH、胆固醇和碱性磷酸酶的比色分析已在μPAD 上得到验证[11]。相关检测中，试纸条测试区出现的颜色强度与分析物的浓度呈现对应关系，配套的阅读器能根据颜色变化来对比标准曲线，最终获得待检指标的定量或半定量的浓度数据。

本系统检测葡萄糖浓度的方法是滴加样品至血糖试纸条然后将试纸条放入适配器中，最后插进检测仪的检测口中等待检测结果。将质控血清加入PBS 缓冲液中分别稀释为：16、12、8、4、2、1 mmol/L 标准品溶液，然后取2 μL 标准品溶液加至试纸条的进样口，在反应时间1 min 内进行检测。

1.3 免疫试纸条检测

本实验中所用的免疫检测试纸条采用的是标准的免疫层析技术。试纸条的检测线（Test-line，简称T线）、质控线（Control-line，简称C 线）处会产生显色反应。通过相应的分析仪或目视判断，就可对试纸条的检测结果进行定性判读。其中C 线用来判断检测是否有效，T 线上的显色深浅度用来判断所检测物的浓度含量[17]，如图1（a）所示。

本论文构建的系统也是基于以上基本原理来判读试纸条检测结果的，分析仪会拍摄试纸条的照片，然后根据适配器里的数据知道T 线和C 线的位置，根据该处是否有颜色变化来给出“阳性”或“阴性”的判读结果，如图1（b）所示。

图1 免疫检测结构图

1.4 检测系统

本文设计的便携式生化及免疫分析仪主要用于生化指标的半定量检测和免疫指标的定性检测。当然，定性还是定量主要是由试纸条本身的特性决定的。满足即时检测需要的通用型分析仪需要具备体积小、可便携方便、检测速度快和精度稳定性灵敏度好等特点。搭建的便携式分析仪的整体外观及内部结果如图2（a）和2（b）所示。当然，为了实现信号的最终展示，该仪器除了能对试纸条的特定区域颜色进行定量检测外，还具备对获得数据的存储与分析，以及最终传输到检测终端的功能。

该便携式分析仪的工作流程是：将待测试纸条放入适配器中再插进仪器检测口；系统中的树莓派处理器驱动摄像头、NFC 模块和LED 光源，NFC 芯片通过射频信号自动识别试纸条卡盒上的线圈目标对象（图2（c））并获取相关数据，数据经I2C 的连接方式传输到树莓派进行处理。摄像头拍摄照片后，系统根据NFC 传输的数据判定试纸条类型，并根据相应的类型选择对应的检测区域，葡萄糖的颜色反应结果（图2（d））及质控线C 和检测线T 的数据经过内部算法得出定性、定量的结果。检测结果保存在SD 卡中，可方便后续处理。仪器可通过USB 连接上位机进行数据传递，上位机PC 端也可控制仪器执行检测操作。

图2 检测系统整体结构图

2 结果和讨论

2.1 通用型分析仪的整体设计方案

便携式生化、免疫分析仪设计之初的检测对象即为用于生化检测及免疫检测的试纸条，旨在通过提取试纸上的颜色信息进而实现对被检测物量化的功能。该分析仪的构建涉及到电子、机械和生化方面的专业知识，属于结构简单但功能齐全的光机电一体化设备。首先，系统需利用光源及树莓派摄像头对检测试纸条上的颜色信息进行提取。其次，由于树莓派摄像头中CMOS 图像传感器可以直接将光信号转换成数字电信号，并且NFC 通信接收的数据也为数字信号，因此无须对信号进行处理。接着，系统中央处理器需通过提取到的有效数据进行运算，完成对检测条信息量化的过程。最后，需要输出单元将量化信息进行输出。因此整个系统按功能可分为以下3 个部分，信号采集、数据运算和人机交互。

信号采集部分包括检测区域显色区域、NFC 标签的信号采集；数据处理部分是将采集到的数字信号传输到中央处理器，对数据进行分析并实现定量计算；人机交互部分则是利用显示屏等输出设备将检测结果以不同形式进行传递。其中信号采集部分作为系统信号的来源，对信号提取的优劣程度直接影响到检测结果的准确性，是整个检测系统中较为关键的部分。

2.2 生化及免疫指标检测系统硬件设计

本文开发的便携式检测仪是一款具有快速准确、携带方便和高精度等特性的仪器。本仪器选用Raspberry Pi Zero W 主控系统，其体积仅有60mm×30mm×5 mm，拥有1 GHz 单核CPU 和512 MB 的RAM，具有性能强、体积小和低功耗的特点，同时保持了高度的集成性能和简易的开发特性。其硬件组成包括嵌入式系统，光电检测模块，NFC 模块，供电模块，信号采集处理模块等。系统采用了树莓派800 万像素摄像头来获得最原始的图片信息，当然单一的CMOS 摄像头成像面积有限，若想实现更大区域的信号检测，采用CMOS 阵列采集信号是一个技术选择。拍照检测系统硬件整体设计如图3 所示。

图3 系统硬件整体设计

2.3 系统软件设计

树莓派开发系统基于Linux 操作系统，本系统软件使用Python 语言开发，调用了OpenCV 软件库完成树莓派摄像头实时拍照应用。系统软件设计的工作流程为在系统上电后首先对系统进行初始化工作，接着进入试纸条类型判别程序，当NFC 芯片接收器检测到试纸条上的不同线圈时，就会分别进入相应的检测程序，系统拍下试纸条相应区域的照片后，对数据进行分析处理，将最终检测结果输出。在进行葡萄糖试纸条的数据分析处理时，用到的最关键的比色分析算法为分别检测出试纸条白色背景区域和颜色反应区域的RGB 值，然后计算出背景的B 值减去反应区域的B 值为a，背景的G 值减去反应区域的G 值为b，将计算出的（a—b）的值与浓度进行匹配。要让系统的各个功能模块互相协作实现检测任务，需要对其行为进行安排，根据检测任务的需求，设计出整体的程序流程图如图4所示，使得各个功能模块可以按照设计好的逻辑顺序实现所需功能。其中根据比色分析算法设计了抠背景模块，防止程序误判断设计了防干扰多次确认模块。

图4 主程序结构流程图

2.4 颜色采集效果的评估

为了测试仪器拍照功能是否能够稳定且一致，首先用仪器连续拍摄了10 张位置固定的标准色块的照片（图5（a）），并观察其RGB 值是否有较大的波动。通过照片和RGB 值数据可以看出，搭建的仪器可以稳定输出图像，同一个RGB 值的图片差异性较小（图5（b）），因此利用该仪器获得定量数据的可行性很高。

图5 重复性实验结果图

2.5 标准曲线的绘制

为了获得准确和可重复的检测结果，获得高质量的图像是前提。分辨率为800 万像素的树莓派摄像头满足了这种需求。通过分析在稳定的照明条件下获得的拍摄照片（图6）发现，血糖浓度与各个浓度下的试纸条颜色强度之间存在明显的相关性。

检测葡萄糖时，由于存在摄像头拍照时的环境干扰等因素，选择通过对同一试纸条进行连续6 次拍照来获得平均信号来降低系统性误差。通过重复实验发现，试纸条背景区域的颜色值与检测区域中的颜色值波动有较高关联性（图6（a）），因此通过背景区域的颜色通道与检测区域的颜色通道相计算可有效提高稳定性。如图6（b）所示，检测区域中的RGB 通道值与背景板区域的RGB 通道值与血糖浓度呈现一定的相关性，通过比较几种归一化的方法，最终选择了相对误差较小的计算数据（（b—t）B—（b—t）G）来绘制标准曲线。如图6（c）所示，相关计算的颜色值与葡萄糖标准溶液浓度的关系具有良好的非线性相关性，R2为0.994 9（图6（c））。人体正常的血糖浓度范围为：3.9~6.1 mmol/L，该检测系统的检测范围（1~12 mmol/L）覆盖了正常的血糖范围，因此可检测异常血糖的需要。该实验初步验证了本论文所构建的系统检测葡萄糖浓度的可行性。

图6 葡萄糖重复性实验及标准曲线图

2.6 葡萄糖试纸条的检测

为了进一步评估构建的分析仪的实用性，测试了血清样本中的葡萄糖含量，并将结果和标准吸光光度法的仪器测量出的结果进行比较。检测葡萄糖时，在葡萄糖检测条中加入2 μL 待测样品，试纸滴加血样后30~60 s 中内，将试纸放入对应的适配器，然后插入检测仪中读取结果，如图7（a）所示。通过检测16 组样品，自研分析仪的检测结果与商用化罗氏血糖仪的检测结果进行比对。2 种检测方法获得的结果如图7（b）所示，2 组数据的相关性非常好。两组结果的线性回归关系为y=0.693 45+0.856 58x，相关系数R2=0.951 2。当然，该系统获得的实验误差（如图7（c）所示）略高于罗氏血糖仪测量的误差，表明基于RGB 通道（0 到255）检测血糖浓度的方法还存在改进空间，但已经初步满足血糖检测的实际需要。见表1。

图7 葡萄糖检测图

表1 葡萄糖浓度检测的重复性（N=6）

2.7 肠毒素免疫试纸条的检测

本论文所开发通用型分析仪的另一个应用领域即为免疫检测。拟利用该分析仪获取免疫试纸条的T 线信号值，用于直接定性判读或半定量分析。

该测试的检测对象为用于金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素的侧向流免疫检测试纸条，该试纸条可检测金黄色葡萄球菌产生的肠毒素A、B、C、D、E 的检测。测试时，我们取100 μL 肠毒素溶液与100 μL PBS 缓冲液混合摇匀，制备成待检液，吸取200 μL 待检液至试剂盒里的金标微孔中充分混匀，室温孵育8 min 后，将检测条置于试纸条卡盒中，仪器将自动进行判别检测类型，并通过判断灰度值阈值读取检测线RGB 数据，并给出最终的判读结果（图8）。

图8 金黄色葡萄球菌肠毒素检测条检测结果

3 结束语

本文设计了一种以Raspberry Pi 为运算、控制核心，以pi camera 来拍照，以PN532 NFC 芯片来读取试纸条数据类型的通用型生物、免疫比色分析仪。该分析仪已经被成功应用于血糖生化检测和肠毒素免疫检测，理论上也具备实现其他类似的生化或免疫检测的可行性。其中，对于血糖的检测限为0.64 mmol/L，低于正常血糖范围（3.9~6.1 mmol/L）。这种基于比色检测的通用型分析仪极大地简化了即时检测对于硬件设备的需求，可进一步发展来适配多种类型试纸条的定量或定性检测。该分析仪结构简单、体积小巧和成本低，非常符合即时检测的需要。

本论文所构建的系统及初步测试结果为后续研发更符合实际应用需要的检测设备奠定了一定的基础。该分析仪在应用于实际检测前还有很多需要改进的地方，如数据采集和数据处理的算法还有优化空间；检测硬件还有提升空间，如采用CMOS 阵列来达到更大视场范围内的多区域并行检测，以提升检测通量。