绵羊NYD-SP27基因对卵母细胞体外发育的影响

吴晓雪，李 娜，袁利明，刘欣杰，刘素平，陈 宁，赛务加甫

(石河子大学动物科技学院，石河子 832003)

随着胚胎工程技术应用逐渐增加，体外培养哺乳动物卵母细胞的条件也受到越来越多研究人员的重视。哺乳动物精子中含有可溶性蛋白质“精子因子”(或精子携带的卵母细胞激活因子)，这些可溶性蛋白质可在配子融合后触发Ca2+振荡。它在精子中的存在可以解释为什么胞浆内精子注射(ICSI)模仿受精导致小鼠和人类卵中Ca2+振荡[1-2]。小鼠睾丸中存在的PLCζ基因可激活小鼠卵母细胞，影响小鼠早期胚胎的发育[3-5]。绵羊PLCζ基因可促进绵羊卵母细胞在体外发育，其有望成为一种体外培养卵母细胞的生物试剂[6],在人类和小鼠精子顶体中发现PLCζ亚型——NYD-SP27[7]。NYD-SP27可能会与PLCζ一样有望成为一种新型的促进卵母细胞体外发育的生物试剂。关于绵羊NYD-SP27基因对绵羊卵母细胞体外发育的影响还未见报道，本研究通过显微注射技术将pEGFP-N1-NYD-SP27导入到绵羊MⅡ卵母细胞中，观察卵母细胞的发育情况，探究NYD-SP27对绵羊卵母细胞体外发育的影响，为揭示哺乳动物早期胚胎发育的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和卵母细胞 pEGFP-N1-NYD-SP27及pEGFP-N1均为石河子大学实验室保存。石河子市屠宰场采集绵羊卵巢，将卵巢放入装有27℃～32℃生理盐水(含双抗)的保温瓶中并尽快带回实验室。

1.1.2 主要试剂 质粒小提试剂盒，无内毒素质粒大提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；限制性内切酶EcoRⅠ，BamHⅠ，Takara 公司产品；胎牛血清(FBS)，GIBCO公司产品。

1.1.3 主要仪器 体式显微镜，显微操作仪，二氧化碳培养箱，PCR仪，电泳仪，北京六一仪器厂生产。

1.2 方法

1.2.1 质粒的准备 PCR鉴定重组质粒pEGFP-N1-NYD-SP27阳性克隆菌液，利用质粒小提试剂盒提取质粒，然后对重组质粒pEGFP-N1-NYD-SP27进行双酶切验证，双酶切反应体系20 μL：模板DNA 10.0 μL，ddH2O 6.0 μL，1×H buffer 2.0 μL，EcoRⅠ 1.0 μL,BamHⅠ 1.0 μL。37℃、180 r/min过夜培养鉴定结果正确的阳性菌液。用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒pEGFP-N1-NYD-SP27，质粒浓度不低于100 ng/μL，质粒提取后放在-20℃保存备用。

1.2.2 卵母细胞的准备 用加入抗生素的生理盐水(37℃预热)冲洗绵羊卵巢 2次～3次，剔除周围的结缔组织后继续用加入抗生素的生理盐水洗涤2次，将预热平衡好的割卵液取出，并将卵巢放入割卵液中，用镊子固定卵巢，肉眼可见卵巢表面含有澄清透明的卵泡，将这些卵泡用11 cm手术刀片切开。在体视显微镜下观察割卵液中胞质均匀、包裹卵丘细胞3层及以上的卵丘-卵母细胞复合体(COCs),并用捡卵针收集，取出预热平衡2 h的成熟液，将挑选好的COCs放入成熟液中冲洗3次，然后将其放入成熟液微滴中培养，培养条件为38.5℃、体积分数为5%的CO2。体外成熟培养22 h后,将COCs放入透明质酸酶中轻微吹打除去颗粒细胞，将去除颗粒细胞的卵母细胞放到显微镜下观察成熟情况，挑出成熟的卵母细胞分组备用。

1.2.3 重组质粒和空载体的显微注射 将挑选出的卵母细胞随机平均分为试验组和对照组。将试验组和对照组的卵母细胞分别放入细胞松弛素中作用5 min，成熟液洗涤3次后，移入操作液微滴中。将重组质粒pEGFP-N1-NYD-SP27用注射针吸取后，穿过透明带，注入到卵母细胞胞质内，随后将注射针缓慢退出(显微注射操作均要在1 h内完成)。对照组卵母细胞注射pEGFP-N1，方法与试验组一致。将两组细胞分别放入SoFaa液微滴中，5% CO2、38.5℃的二氧化碳培养箱中培养。24 h后观察卵母细胞是否进入2-细胞期，48 h后开始统计卵母细胞卵裂率，第7天统计桑葚胚率。

1.2.4 统计分析 所有试验重复4次，用SPSS(25.0)软件中独立样本t检验对试验数据进行统计分析。

2 结果

2.1 重组质粒的鉴定

菌液进行PCR后，将产物通过10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测得到一条大小为1 617 bp的目的条带(图1)，与预期结果相符；双酶切鉴定重组质粒后，得到一条为5 452 bp的载体线性片段，另一条为1 617 bp的目的片段(图2)，片段大小与预期结果相符。

M.DNA标准DL 2 000；1.阴性对照；2～8.菌液PCR产物

M.DNA标准DL 10 000；1～2.EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切产物；3.阴性对照

2.2 重组质粒和空载体的显微注射

显微注射重组质粒pEGFP-N1-NYD-SP27及空载pEGFP-N1(图3)48 h后，在荧光倒置显微镜下可观察到两组卵母细胞均发出绿色荧光(图4)，显微注射pEGFP-N1-NYD-SP27表达载体的卵母细胞发生卵裂，注射空载体的卵母细胞没有卵裂。

图3 卵母细胞显微注射(20×)

A.注射pEGFP-N1空载体的卵母细胞(明场)；B.注射pEGFP-N1空载体的卵母细胞(荧光)；C.注射pEGFP-N1-NYD-SP27重组质粒的卵母细胞(明场)；D.注射pEGFP-NYD-SP27重组质粒的卵母细胞(荧光)

2.3 卵母细胞体外发育情况

载体注射48 h后，在倒置荧光显微镜下观察卵母细胞发育情况统计分析卵母细胞发育率。结果显示，对照组的卵母细胞没有继续发育，而试验组的卵母细胞可以继续发育(图5)，卵裂率为46%±0.8%，差异极显著(P<0.01)，桑葚胚率为13.3%±0.5%，差异极显著(P<0.01)。

图5 NYD-SP27注射组卵母细胞发育情况(20×)

3 讨论

不同的物理或化学方法皆可使一些哺乳动物的卵母细胞在体外继续发育，最常用的为6D联合离子霉素，但这种方法可能不利于卵母细胞的后期发育[8-10]。小鼠NYD-SP27和牛NYD-SP27在活性上具有特异性差异，这两种蛋白在作用方式上可能存在差异[11]。精子NYD-SP27蛋白含量的物种间差异，以及卵母细胞NYD-SP27底物的定位和有效性的特异性差异[12-13]，可能有助于优化卵母细胞体外发育的条件。PLCζ基因可以使绵羊卵母细胞在体外继续发育，PLCζ基因在生殖发育中有重要作用[14]。PLCζ家族中的睾丸发育特异性蛋白-27基因(NYD-SP27)[15]是否能够同PLCζ一样具有使哺乳动物细胞体外发育的能力还有待研究，本研究将NYD-SP27导入到绵羊卵母细胞中，初步研究其对绵羊卵母细胞体外发育的影响。

本研究将pEGFP-N1-NYD-SP27与pEGFP-N1通过显微注射技术注入卵母细胞48 h后，两组细胞均可在倒置荧光显微镜下清晰地观察到绿色荧光。其中试验组注射重组质粒pEGFP-N1-NYD-SP27的卵母细胞发生卵裂，并继续发育到桑葚胚。对照组注射pEGFP-N1的卵母细胞未发生卵裂。在注射后48 h后，对两组细胞的发育情况进行了统计分析，注射pEGFP-N1的对照组卵母细胞卵裂率为0，桑葚胚率为0；注射pEGFP-N1-NYD-SP27的试验组卵母细胞卵裂率为46%±0.8%，桑葚胚率为13.3%±0.5%，差异极显著(均P<0.01)，表明NYD-SP27可以促进绵羊卵母细胞在体外发育。

哺乳动物卵母细胞可在体外继续发育与卵母细胞内Ca2+波动有关[16-18]，PLCγ1基因调控小鼠卵母细胞内钙离子水平，使卵母细胞恢复减数分裂，继续发育[19]。PLCζ基因可引起小鼠卵母细胞内钙离子波动[20]，使小鼠卵母细胞会继续发育。NYD-SP27能够引起牛、鼠卵母细胞内钙振荡，且牛卵母细胞内所产生的振荡是小鼠的10倍[21]。因此，NYD-SP27基因是否也是通过调节卵母细胞内钙离子水平来影响绵羊卵母细胞体外发育的能力还有待探究。

本研究将NYD-SP27基因成功导入绵羊卵母细胞中，并使卵母细胞在体外成功发育到桑葚胚，初步探讨了NYD-SP27蛋白对绵羊卵母细胞体外发育的作用，为进一步探讨NYD-SP27基因对哺乳动物早期胚胎体外发育机制提供理论依据。