中华鹅膏菌菌株WPAS01的基因组特性及气味物质分析*

钟馨林，钟欣仪，林隆基，李岳峰，邓优锦**

（1．福建农林大学林学院，福建 福州 350002；2．福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002）

中华鹅膏菌 （Amanita sinensis） 是担子菌门（Basidiomycota） 伞菌目 （Agaricales） 鹅膏菌属（Amanita） 的一种大型真菌，通常与壳斗科和松属植物的树根共生，形成外生菌根[1]。中华鹅膏菌在我国主要分布在福建、云南、广东、四川、贵州、湖南等省份。在福建的闽西北地区，如尤溪、德化、武平、漳平等县域，中华鹅膏菌也被称为松果伞、麻丝菇，主要生长在马尾松林下，是当地村民采食的主要野生食用菌之一[2]。该菌子实体较大，高度及菌盖直径分别可达40 cm和12 cm，散发浓郁香气，且味道鲜美、营养丰富，具有很高的经济价值。

目前，人们对中华鹅膏菌的了解和研究较少。以福建省武平县采集的一株野生中华鹅膏菌为研究对象，从生长环境、形态特征、分类地位、基因组特性以及气味物质等多个方面进行研究，为后续研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 供试样品

供试菌株为中华鹅膏菌WPAS01，采集自福建省武平县岩前镇的将军山。基因组测序和气味物质测定的供试样品均使用其菌盖（直径为10 cm～12 cm）。

1.2 DNA提取与基因组测序

采用改良后的CTAB法提取中华鹅膏菌WPAS01总DNA。准确称取0．2 g新鲜菌盖样品至2 ml离心管中，加入600 mL质量浓度为2 g·mL-1的CTAB溶液和10 μL的 β-巯基乙醇，迅速混匀后置于65℃水浴锅中水浴30 min，期间每5分钟上下颠倒混匀20次；加入等体积的混合液V（苯酚）∶V（氯仿）∶V（异戊醇）=25∶24∶1，充分混合，在 12 000 r·min-1、20℃下离心10 min，取上清液（重复2次）；加入异丙醇（体积为上清液体积的70%），混合均匀，于-20℃静置30 min使DNA沉淀，4℃离心10 min，去除上清液；沉淀中加入1 mL经预冷体积分数为70%的乙醇，上下颠倒摇匀，4℃离心10 min，去除上清液，通风晾干；加入50 μL无菌水（含0．05 mg RNase） 溶解沉淀，于37℃水浴锅中水浴30 min。提取的DNA送由诺禾致源生物科技有限公司（天津） 进行文库构建和DNA测序，采用Illunima HiSeq X 10测序平台测序，拟获得4 Gb～6 Gb双末端原始测序序列。

1.3 种属鉴定

从NCBI的GenBank数据库中下载A.sinensis HKAS 25761的 ITS序列 （NCBI accession number：NR_119389．1），作为参考序列。采用本地BLASTN[3]将WPAS01菌株的原始测序reads序列与参考序列进行比对，设置E值为10-5，以表格形式输出。通过Seqtk[4]软件中的subseq命令提取出匹配的reads序列，利用CAP3程序[5]组装序列。以ITS1和ITS4的引物序列为边界，将组装获得的序列截成ITS序列。提交WPAS01菌株的ITS序列至GenBank的NR数据库中，通过BLASTN从分子水平分析其分类地位。

下载NR数据库中与WPAS01菌株的ITS序列相似性最高的DNA序列。采用Mega 11软件[6]中的ClustalX进行序列比对，设置空位开口罚分为15．00，空位延伸罚分为6．66。采用Neighbor-joining法构建系统进化树，完全删除空位或丢失数据。

1.4 基因组信息分析

采用Jellyfish软件分析K-mer count分布，K-mer设置为21。将分布结果上传至在线工具Genome Scope[7]预测WPAS01菌株基因组大小、杂合度和重复序列的比例。测序数据采用SPAdes 3．14．0软件[8]进行组装，设置梯度K-mer值为75、 97、 113和127。组装结果采用BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs） 软件[9]进行完整性评估，使用Funannotate软件[10]进行基因组注释。

1.5 气味物质测定与数据分析

称取4 g～5 g新鲜的WPAS01菌盖样品至50 mL离心管中，在液氮中迅速降温，保存于超低温冰箱。样品送由迈维代谢生物科技有限公司（浙江嘉兴）进行预处理和气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）测序。

GC-MS分析获取的原始数据文件使用安捷伦MassHunter软件进行峰提取，获得特征峰的质荷比、保留时间和峰面积等信息；所得质谱图经MWGC数据库（迈维代谢建立的一个针对植物挥发性物质的专一数据库）检索，并与数据库中的标准图谱核对，确定物质化学组成；采用unit variance scaling（UV）归一化处理方法计算代谢物含量数据。

2 结果与分析

2.1 WPAS01菌株的生境与形态特征

WPAS01菌株子实体采集自福建省武平县岩前镇的将军山马尾松人工林区 （116°6′48″E，24°48′48″N，海拔为460 m）。环境昼夜温差较大，温度为18℃～28℃，相对湿度维持在75%以上。WPAS01菌株的野生子实体形态及其生长环境见图1。

图1 WPAS01菌株的子实体形态与生长环境Fig．1 Fruit body morphology and growth environment of strain WPAS01

如图1所示，所采集的WPAS01菌株子实体为单生；菌盖呈伞状，深灰色，干燥且具有皱纹，表皮被有深灰色残余疣状菌幕，成熟时直径为7 cm～12 cm；菌肉和菌褶均为白色，菌柄近圆柱形，根部也被有深灰色残余疣状菌幕，内部松软。

2.2 WPAS01菌株的种属鉴定

经Illumina测序获得300 bp的1．45×107对双末端片段，共计4．36 Gb原始数据。经组装，WPAS01菌株的ITS区域介于ITS1和ITS4引物间的序列长度为695 bp。NCBI-BLASTN结果显示，按score值排列的前20个均为中华鹅膏菌。使用Neighbor-joining法构建ITS序列系统进化树，见图2。

图2 ITS序列的系统进化树Fig．2 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由图2可知，21个菌株可以聚成4组，其中WPAS01、HKAS100492、AS3和WM42菌株归为D组。HKAS100492菌株为2013年采自于福建省漳平县山区（海拔为300 m）的中华鹅膏菌，与WPAS01菌株的ITS序列相似性为100%。WPAS01菌株与B组菌株的差异最大，其中FB-30955、FB-12189和FB-30983菌株的相似性均小于90%。

2.3 中华鹅膏菌WPAS01菌株的基因组特征

使用GenomeScope对基因组测序数据进行评估的结果显示，WPAS01菌株的单倍体基因组为47．54 Mb，其中46．23%为重复序列，杂合率为2．02%。使用SPAdes软件组装原始数据，得到46 845个contig片段，Contig N50的值为4 661 bp，合计69．54 Mb，（G+C）含量为48．09%。对基因组装的完整性进行评估，完整的BUSCOs（complete BUSCOs） 共有1 556个，占担子菌总数的88．2%；片段化的BUSCOs（fragmented BUSCOs） 共有112个，占6．3%；缺失的BUSCOs（missing BUSCOs） 共有 96 个，占 5．5%；结果表明，组装的基因组比较完整，基本满足后续基因序列分析的需求。使用Funannotate软件对所组装的基因组进行预测，基因组基本情况见表1。

表1 中华鹅膏菌WPAS01菌株基因组的基本情况Tab．1 Basic information of Amanita sinensis strain WPAS01

由表1可知，中华鹅膏菌WPAS01菌株组装基因组共得到21 619个基因，平均长度为1 096 bp，占基因组总长度的49．8%；蛋白编码区（coding sequence，CDS） 的平均长度为1 016 bp。

2.4 中华鹅膏菌WPAS01菌株的气味物质

中华鹅膏菌WPAS01菌株的挥发性成分经GCMS联机测定和计算机谱库检索，共检测出135种挥发性成分，共同组成了其独特香气。按照气味物质的相对含量从高到低进行排列，前20种气味物质详见表2。

表2 中华鹅膏菌WPAS01菌株子实体的20种主要气味物质特征Tab.2 Characteristics of 20 main odor substances from fruit body of Amanita sinensis strain WPAS01

如表2所示，中华鹅膏菌WPAS01菌株子实体中含量最高的前3种气味物质分别为4，6-二甲基-异噻唑并[5，4-b]吡啶-3-酮、3-[1-吡咯烷基]-氮杂环己烷、顺-13-十八碳烯酸，均超过10%。这20种气味物质中，苯乙醛[18]、正十六烷酸[13]、1-辛烯-3-醇[14]、1-辛烯-3-酮[21]等的相关研究已较为深入。例如，苯乙醛的研究结果表明，其由芳香族氨基酸经过艾氏途径降解而成，具有类似风信子的香气，在制作桂花、刺槐等香精时有提调香气的作用，并广泛运用于香料产业[18]。

分析得到的135种挥发性成分的化学性质及分类，结果见图3。

图3 135种挥发性成分化合物类型分布情况Fig.3 Distribution of the 135 volatile component compound types

由图3可知，在分析出的135种挥发性成分中，烃类有36种，占总数的26.7%；酸酯类有34种，占25.2%；醛类有19种，占14.1%；芳香族杂环化合物和酮类均分别占总数的10.4%；10种醇类占7.4%；酚类和醚类各1种，分别占总数的0.7%；其他6种挥发性成分占4.4%。由此可见，烃类、酸酯类和醛类是中华鹅膏菌WPAS01菌株的主要香气成分。

将分析得到的135种挥发性成分与茶树菇（Agrocybe chaxinggu）、杏鲍菇（Pleurotus eryngii）、平菇 （Pleurotus ostreatus）、香菇 （Lentinus edodes）、金针菇（Flammulina velutipes）、金福菇（Tricholoma lobayense）、双孢蘑菇 （Agaricus brunnescens） 7种常见食用菌所含的气味物质[23]进行对比，结果见表3。

表3 中华鹅膏菌WPAS01菌株与其他7种食用菌的共有气味物质分布情况Tab.3 Distribution of common odor substances between Amanita sinensis strain WPAS01 and other seven edible fungi

由表3可知，在其他7种常见的食用菌中也被发现的15种气味化学物质在WPAS01菌株中占135种气味物质总质量的21.16%。其中，苯乙醛在WPAS01菌株中的含量最高，占5.67%；其也普遍存在于其他食用菌中，在除双孢蘑菇外的6种食用菌中都有发现。中华鹅膏菌WPAS01菌株与金福菇共有的气味物质最多，为9种；与金针菇含有的气味物质最不相同，共有的只有2种。

2.5 苯乙醛的合成途径关键酶基因检测结果

苯乙醛是中华鹅膏与其他食用菌共有香气物质中含量最高的，也是生物合成2-苯乙醇的前体。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 中，生物合成2-苯乙醇有2种途径，包括莽草酸途径和艾氏通路[24]。对中华鹅膏菌WPAS01菌株包含编码2个途径所有关键酶的基因进行检测，通过检测结果拟合苯乙醛在其中的合成途径，详见表4和图4。

表4 中华鹅膏菌WPAS01菌株基因组中苯乙醛合成通路的预测基因Tab.4 Predicted genes for phenylacetaldehyde synthesis pathways in genome of Amanita sinensis strain WPAS01

图4 中华鹅膏菌WPAS01菌株中苯乙醛拟生物合成途径Fig.4 Predicted biosynthesis pathway of phenylacetaldehyde in Amanita sinensis strain WPAS01

由表4和图4可知，中华鹅膏菌WPAS01菌株包含编码苯乙醛2个合成途径中所有关键酶的基因，由此预测中华鹅膏均能利用这2个途径合成苯乙醛。其中，莽草酸通路是经由糖酵解生成的磷酸烯醇式丙酮酸和戊糖磷酸途径生成的4-磷酸赤藓糖，通过3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸合酶（WPAS01_001159）、分支酸合成酶 （WPAS01_001879，WPAS01_001106，WPAS01_016450）、分支酸变位酶 （WPAS01_004237）、预苯酸脱水酶（WPAS01_014788,WPAS01_007266，WPAS01_000604） 和苯丙酮酸脱羧酶 （WPAS01_001064，WPAS01_001143）等关键酶的逐步催化，形成苯乙醛。艾氏通路是进入体内的L-苯丙氨酸先经芳香氨基酸氨基转移酶（WPAS01_004649） 催化生成苯丙酮酸，再经苯丙酮酸脱羧酶（WPAS01_001064，WPAS01_001143）催化生成苯乙醛。

3 讨论

中华鹅膏菌群体间的形态特征和DNA序列具有一定的差异，菌盖颜色呈灰白色至深灰色，表皮颜色呈灰色至深灰色，表皮状菌幕残余为疣状至颗粒状，菌柄内部松软至空心[25]。从福建省武平县的马尾松人工林区采集到的该中华鹅膏菌WPAS01菌株的菌盖呈深灰色，表皮被深灰色疣状菌幕残余，菌柄内部实心。根据ITS序列相似性，WPAS01菌株与HKAS100492菌株的ITS序列一致，且采集地均属于龙岩市，两地距离约为200 km，具有相近的生态环境。

采用SPAdes软件对WPAS01菌株进行基因组装，获得基因组组装大小为69.54 Mb，但该数值受到异核菌株杂合度、组装软件、测序片段长度、测序数据量和设定的K-mer值等因素的影响，无法代表该基因组的真实值。因此，通过采用GenomeScope对基因组测序数据进行评估，结果表明WPAS01菌株的单倍体基因组为47.54 Mb，杂合度为2.02%。已有研究对1 850个真菌物种进行评估[26]，真菌基因组的平均大小为44.2 Mb，该中华鹅膏菌WPAS01菌株基因组略大于这一平均值。

散发浓郁而特殊的香味是中华鹅膏菌的特色之一。通过检测发现，中华鹅膏菌WPAS01菌株子实体中含有135种气味化学物质，通过与常见的7种食用菌进行对比，其中只有15种气味化学物质为与一种或多种食用菌共有，占化合物总数的11.1%，占总含量的21.16%。已有研究表明，不同的栽培基质、培养环境以及生长环境，子实体的气味化学物质会产生一定的差异[27]。若使用同样的栽培基质在同一环境中培养中华鹅膏菌WPAS01菌株以及其他7种食用菌，同一发育时期的子实体中不同菌株共有的气味化学物质可能会产生变化，但特有香味化学物质仍然是中华鹅膏菌气味的主体。

此次通过对中华鹅膏菌WPAS01菌株气味物质的分析，以及预测其基因组在苯乙醛合成通路中的特性，以期为中华鹅膏菌在香料等精深加工产业中的开发利用提供参考。