纳米羟基磷灰石复合材料在骨组织工程支架中的研究现状

王伟佳，唐 硕，马应钧，章 娜，蒋柳云，张 燕

(湖南师范大学化学化工学院，中国 长沙 410081)

由于创伤、感染、骨肿瘤等造成的骨缺损十分常见。目前用于临床移植的骨替代物主要有自体骨、同种异体骨、异种骨以及金属、陶瓷、聚合物等合成材料，但其在骨科中应用存在各自的优缺点。近年来，随着组织工程学的迅速发展，骨组织工程学为骨缺损的治疗提供了一种可供选择的新方法[1]。骨组织工程中3个要素是不可或缺的，即支架材料、种子细胞和信号因子。其中支架材料作为细胞和信号因子的载体，为骨组织生长提供特有的微结构和微环境，是骨组织工程研究的关键问题。在骨组织工程应用中，通常理想的骨组织工程支架材料需满足以下几个方面的要求：良好的生物相容性、合适的可降解性、具有三维多孔且相互贯通的网络结构和一定的机械强度[2]。大量研究表明，模仿天然骨的组分进行设计，有利于为细胞黏附、生长、增殖提供更合适的微环境，可促进血管化骨形成及骨组织生长，这是获得性能优异的骨组织工程支架材料的最有效途径。

纳米羟基磷灰石(n-HA) 是天然骨骼中的主要矿物质，因其具有与人体骨骼相似的化学和物理特性，生物活性和骨传导性良好，无论是制备假体植入物、支架还是人工骨水泥，羟基磷灰石都备受关注[3,4]。但其单独使用时脆性较大且加工性能较差，因而其应用受到严重限制。而将其与其他物质复合，有望获得高强度、高成骨活性的复合支架，这是骨组织工程研究的重要方向[5]。因此，本文对n-HA与天然高分子、合成高分子、无机材料以及其他活性因子的复合材料的理化性能及生物学性能以及在骨组织工程支架材料中的研究现状进行综述，为制备高性能骨组织工程支架材料提供参考。

1 n-HA/天然高分子复合材料

1.1 n-HA/胶原(n-HAC)复合材料

胶原蛋白(Col)和羟基磷灰石(HA)分别是天然骨骼中最丰富的蛋白质和主要成分，由于胶原蛋白和羟基磷灰石优异的生物相容性和生物降解性，它们通常被用作骨组织工程中的仿生复合材料。Chen等[6]通过逐步添加HA的Col分层组装，在迭代分层冻干工艺的辅助下，制备了一种新型仿生多孔胶原(Col)/羟基磷灰石(HA)支架。在新型仿生多孔胶原(Col)/羟基磷灰石(HA)支架上细胞增殖、碱性磷酸酶活性和体外成骨分化都有显著增加，表明优良的Col/HA支架在骨组织工程中具有潜在的应用前景。Yu等[7]通过仿生方法建立了新型Col-HA支架，同时在支架中添加铁、锰两种微量元素，以增强骨组织工程支架的新骨再生能力，新型支架表现出更好的成骨能力，且有利于骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外成骨分化和体内骨再生，该研究为创建用于骨再生的功能性支架提供了一种简单而实用的策略。

1.2 n-HA/壳聚糖(CS)复合材料

壳聚糖(CS)作为甲壳素衍生的天然聚合物，在骨组织工程中发挥了重要作用[8]。CS为带阳离子的高分子碱性多糖聚合物，具有良好的生物相容性、微生物降解性以及细胞黏附性，在体内的降解产物无毒性和刺激性，且具有优良的抗菌性、可塑性，适合细胞向内生长和骨传导。近年来，以壳聚糖、n-HA为基础组分的多相复合人工骨已成为研究的热点方向。Dai等[9]制备了三维壳聚糖(CS)/蜂窝多孔碳/羟基磷灰石复合材料，合成方法如图 1所示。新型支架具有分层孔和有机-无机成分，其组成和结构与骨组织相似，具有较高的孔隙率和一定的机械强度。三维壳聚糖(CS)/蜂窝多孔碳/羟基磷灰石复合支架可促进干细胞生长并促进其分化为成骨，在促进骨缺损区骨形成方面也具有显著优势。各项实验均表明CS/HPC/n-HA支架在骨组织工程中具有良好的应用前景。叶鹏等[10]制备了三维丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架，该负荷型抗生素支架具有良好的缓释性能、抗压性及吸水率和水溶性损失率，应用前景良好。本课题组[11]为提高n-HA/CS复合支架的力学性能，采用引入聚阴离子性的羧甲基纤维素与壳聚糖进行离子交联，采用冷冻干燥法获得了相互贯通的高强度多孔材料，有望用于骨组织工程支架。最近本课题组[12]又研究了羧基化改性的竹纤维，可以对n-HA/CS复合支架的力学性能及降解性有更好的改善，在骨组织工程支架中有较大的应用前景。

图1 蜂窝方案多孔的碳合成及其在成骨细胞分化中的潜在应用Fig. 1 Synthesis of cellular porous carbon and its potential application in osteoblast differentiation

1.3 n-HA/丝素蛋白(SF)复合材料

丝素蛋白(silk fibroin，SF)是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，具有优异的韧性、延展性和可塑性[13]。其含有 18 种氨基酸，易于在侧链进行化学修饰而改变其性能。丝素蛋白在体内降解缓慢，产物安全、无毒性。因其优越的生物降解性、良好的生物相容性和极其轻微的炎症反应，使其在骨组织工程研究中成为关注的焦点[14]。孙庆治[15]制备了一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合人工骨材料。通过小鼠体内实验发现，随着时间的增长小鼠体内的人工骨材料被完全降解吸收、被新生骨质替代，骨缺损区完全愈合。这证实了纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合人工骨材料可促进骨缺损修复，具有较强的成骨能力。Xu等[16]采用紫外交联法制备了3种不同比例的丝素蛋白和羟基磷灰石组成的多孔支架材料。各项表征证实该丝素蛋白/羟基磷灰石支架的抗压强度、弹性模量和孔隙率均较为理想。体内实验可以观察到丝素蛋白/羟基磷灰石支架植入后明显促进了股骨缺损的修复。因此，丝素蛋白/羟基磷灰石支架是一种很有前途的骨组织工程材料。Niu等[17]采用静电纺丝技术制备了含有羟基磷灰石(HA)纳米颗粒和骨形态发生蛋白2(BMP-2)的纳米纤维丝素蛋白(SF)支架。采用骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行的细胞培养实验表明，纳米纤维丝素蛋白(SF)支架具有良好的生物相容性，并可促进BMSC的成骨分化。因此，静电纺丝SF/HA/BMP-2支架可作为骨组织工程很有前途的生物材料。

2 n-HA/合成高分子复合材料

2.1 n-HA/聚乳酸(PLA)复合材料

聚乳酸(polylacticacid，PLA)因其具有良好的生物相容性、降解性及成形性，成为骨组织工程中应用最广泛的合成聚合物之一[18]。但作为支架材料，聚乳酸降解速度过快，容易产生一些酸性降解产物，同时细胞黏附性较差，不利于周围细胞的增殖与生长。而n-HA在酸性介质中会因溶解度的提高而形成微碱性环境，与聚乳酸的酸性降解产物反应，导致缓冲细胞周围环境 pH 的下降，减轻单独使用聚乳酸材料造成的炎症反应，因此将PLA与n-HA两者复合会得到性能更优异的材料。

李刚等[19]制备了一种纳米羟基磷灰石(n-HA)/聚乳酸(PLA)复合材料。XRD测试结果表明n-HA的添加可以促进聚乳酸的结晶，为聚乳酸的结晶研究提供了参考。同时，SEM图表明最佳的添加比例为m(HA)∶m(PLA)=1∶10，此条件下制得的样品具有较好的成孔性，如图2所示。魏安方等[20]采用静电纺丝的方法制得了一种纳米羟基磷灰石(n-HA)/聚乳酸(PLA)复合纳米纤维支架材料。当n-HA质量分数为10%时，其在聚乳酸纳米纤维表面均匀分布，使得n-HA/PLA复合纳米纤维支架材料的断裂强度、断裂伸长率达到最大，热力学性能也明显提高。Liu等[21]通过相分离方法制备聚乳酸/羟基磷灰石(PLA/HA)复合纳米纤维支架以模仿天然细胞外基质(ECM)。各种表征分析可得：HA的添加提高了复合支架的热分解温度，同时复合支架亲水性增加，具有很大应用前景。为提高其力学性能，本课题组[22]将天然竹纤维添加到n-HA/PLGA复合支架中，通过对其力学性能、降解性能及生物学性能进行测试，发现所得新型复合多孔材料满足骨组织工程支架材料的性能要求。

图2 不同质量比n-HA/PLA复合支架的SEM形貌，(a) m(n-HA)∶m(PLA)=0∶10;(b) m(n-HA)∶m(PLA)=1∶10;(c) m(n-HA)∶m(PLA)=2∶10;(d) m(n-HA)∶m(PLA)=3∶10;(e) m(n-HA)∶m(PLA)=4∶10Fig. 2 SEM images of n-HA/PLA composite scaffolds with different mass ratios，(a) m(n-HA)∶m(PLA)=0∶10,(b) m(n-HA)∶m(PLA)=1∶10,(c) m(n-HA)∶m(PLA)=2∶10,(d) m(n-HA)∶m(PLA)=3∶10,and (e) m(n-HA)∶m(PLA)=4∶10

2.2 n-HA/聚酰胺(PA)复合材料

图3 静电纺丝PA6/CS纤维支架形成示意图 Fig. 3 Schematic diagram for the formation of electrospun PA6/CS fiber scaffolds

PA俗称“尼龙”，具有良好的耐热性、耐磨损性、自润滑性，易于加工，常用的有 PA6 和 PA66。聚酰胺-6(PA6)是一种合成聚合物，其骨架与胶原蛋白相似，在人体体液中具有出色的稳定性。因此n-HA/PA 新型骨组织工程材料是近年来的研究热点之一。You等[23]制备了纳米羟基磷灰石/聚酰胺-66(n-HA/PA66)复合支架，具有轴向对齐的通道(300 μm)。与各向同性支架相比，具有轴向对齐通道的各向异性支架具有更好的机械性能和更高的孔隙率(86.37%)，可促进支架内的细胞附着和增殖，更好地促进新骨向内孔生长。各向异性支架还改善了血管对其内部的侵袭，增加了供应细胞的氧气和营养物质，从而促进了血运重建和骨内生长。因此，这种支架在骨组织工程中具有巨大的应用潜力。Chen等[24]比较了新型高度可调纳米羟基磷灰石/聚酰胺-66椎体(HAVB)与钛网笼(TMC)和人造椎体(AVB)的生物力学特性，经测试发现与TMC和AVB相比，HAVB在脊柱稳定性重建方面具有相似的生物力学功效，并可大大减少与植入物相关的并发症，因此纳米羟基磷灰石/聚酰胺-66复合材料被证明是脊柱稳定性重建的潜在可行选择。Niu等[25]采用静电纺丝技术制备了静电纺丝PA6/CS支架(如图3所示)，发现该支架矿化后，HA颗粒均匀分布在PA6/CS纤维支架表面，呈多孔蜂窝状结构，矿物含量约为40%；此外，细胞培养结果表明，矿化的PA6/CS复合支架无细胞毒性，具有良好的生物相容性和促进MC3T3-E1细胞附着和增殖的能力。

2.3 n-HA/聚己内酯(PCL)复合材料

聚己内酯(poly-caprolactone，PCL)具有性能稳定、成本低、生物相容性好等优点，是骨和软骨领域的一种很有前途的生物可吸收聚合物，在骨组织工程研究中被广泛应用于三维支架的制备。但纯PCL支架亲水性差、生物活性低，限制了其在生物医学领域的应用。随着骨组织工程材料研究的发展，大量研究者将PCL与纳米羟基磷灰石进行复合，以改善支架性能或引入新的性能。向声燚等[26]以纳米羟基磷灰石(n-HA)和聚己内酯(PCL)为原料，通过熔融共混方式制备了不同n-HA含量的PCL/Nano-HA复合材料，发现在n-HA质量分数为20%时，3D打印试样的拉伸强度和弯曲强度均达到最大值；当压缩应变为10%时，n-HA质量分数为40%的PCL/n-HA复合材料试样的压缩应力为最大值，如图4和图5。PCL/n-HA复合材料有利于其保持良好的生物活性，有望在骨组织支架中得到应用。El-Habashy等[27]使用简单制备技术实现了羟基磷灰石/聚己内酯纳米颗粒(HA/PCL NPs)的杂交，杂交 HA/PCL NPs 在间充质细胞增殖和骨分散方面优于羟基磷灰石纳米颗粒(n-HA)，同时降低了细胞毒性。各种测试结果表明混合生物活性HA/PCL NPs可以提供比普通n-HA更突出的成骨潜力，作为独立的纳米平台或作为复杂工程系统的一部分用于骨再生应用。

图4 不同n-HA质量分数下PCL/n-HA复合材料3D打印试样的拉伸强度和弯曲强度Fig. 4 Tensile strength and bending strength of 3D printed samples for PCL/n-HA composites with different n-HA weight fractions

图5 不同n-HA质量分数下PCL/n-HA复合材料3D打印试样的压缩应力-压缩应变曲线Fig. 5 Compressive stress-strain curve of 3D printed samples for PCL/n-HA composites with different n-HA weight fractions

3 n-HA/无机粒子复合材料

石墨烯(Graphene)是一种由sp2杂化碳原子构成的平面蜂窝结构，厚度相当于一个原子的薄膜。石墨烯与氧化石墨烯(Graphene Oxide，GO)因高强度、高韧性、以及可影响纳米材料的微观结构和力学性能而被广泛应用于组织工程领域[28]。

Maleki-Ghaleh等[29]合成了锌掺杂羟基磷灰石/石墨烯，各种表征证实其是具有抗菌和生物活性的纳米复合材料，可用于骨组织工程。羟基磷灰石纳米颗粒的抗菌性能在锌掺杂和与石墨烯进一步合成后都分别有提高。经体外细胞评估结果表明，培养基中的羟基磷灰石纳米颗粒不仅无毒，还增强了骨髓干细胞增殖能力。这种掺杂羟基磷灰石/石墨烯材料具备了骨组织工程所需的理想的生物学特性。Li等[30]制备了海胆样羟基磷灰石/石墨烯空心微球作为pH响应骨药物载体。复合微球具有海胆状结构，且BET表面积大、分散性好。实验表明，复合药物载体无细胞毒性，且缓释性和pH响应性良好，因此其作为骨药物载体很有前途。Stefania 等[31]通过一种绿色友好且室温下可规模化生产的碱性共沉淀法合成了右旋糖酐接枝氧化铁纳米结构材料(DM)，并用于功能化n-HA晶体。在纳米复合材料中加入不同量的DM杂化材料，合成过程中添加DM不会影响产物(DM/n-HA纳米复合材料)的初生晶畴。增殖实验显示，若没有外部磁场，则不受所用DM量的影响。有趣的是，分析还表明DM/n-HA纳米复合材料对DM颗粒单独诱导的抗增殖活性可能具有屏蔽作用，所获得的异质结构可用于制造预期的生物器件，作为骨填充剂和机械传导剂。

4 n-HA/生长因子复合材料

骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP) 是一种存在于骨基质中的酸性多肽类物质，可以诱导骨髓基质干细胞及未分化的间充质细胞向成软骨细胞和骨细胞转化。BMP 已被成功用于骨折、骨延迟愈合以及骨缺损的治疗。因此，BMP 与纳米羟基磷灰石支架材料进行复合便具有既能填充缺损局部进行力学支撑，又能加速骨愈合的优势，成为近年来骨组织工程研究的热点。

Bal等[32]通过体内实验和体外实验探讨了PLA-PEG和n-HA复合材料作为BMP-2载体的有效性。实验结果证实n-HA/PLA-PEG复合材料通过低剂量BMP-2实现有效的骨再生，这种新型复合材料在临床应用(脊柱融合、大骨缺损和非愈合)中具有极大的潜力。Zhu等[33]制备了一种n-HA/rhBMP-2复合人造骨材料，通过对照实验发现Adv-hBMP-2/MC3T3-E1纳米HA复合人造骨相对于MC3T3-E1纳米HA复合人造骨或纳米HA人造骨具有更强的骨缺损修复能力，在临床治疗骨缺损中大有前景。Cai等[34]使用混合和冷冻干燥法来开发BMP-2-n-HA-COL支架。这种BMP-2-n-HA-COL支架未表现出生物毒性，并且被证明可以促进BMSC的黏附、增殖和分化，因此可以进一步修饰以构建优化的支架，以用于未来的骨组织工程。

5 结语与展望

仿生n-HA复合材料合成步骤简单，兼具优异的机械性能和生物性能，与单纯的HA材料相比具有明显的优越性，在骨组织工程领域具有极大的应用潜力。但对于n-HA复合材料用于骨组织工程支架的研究有以下几个方面值得进一步深入思考：(1)关于n-HA基复合支架的力学性能，一方面由于n-HA纳米粒子固有的易团聚性，使其很难在高聚物中均匀分散，以致难以获得高强度多孔材料，故可考虑对n-HA表面进行改性，以提高其与高聚物的界面结合性；另一方面，随着人们对天然纤维研究的深入，使用天然麻纤维、竹纤维、蚕丝等增加其强度是一种有效途径。(2)关于n-HA基复合支架的成骨活性，虽然n-HA与骨的无机组分类似，但还是存在一些微量元素的差别，仅靠单一模拟天然骨组分的n-HA多孔复合材料用于骨组织工程支架，其成骨活性不足，难以满足血管化骨的形成。因而一方面可考虑对n-HA本身进行微量元素掺杂或引入具有成骨活性的小分子制备杂化纳米磷灰石；另一方面也可考虑引入黄酮类小分子代替价格高昂的生长因子来获得高成骨活性的多孔支架。(3)不可忽略的是，支架材料植入骨缺损处不可避免地会带来细菌感染，导致的长期炎症对骨和周围软组织造成严重损伤，不利于骨组织生长，因而n-HA基多孔材料的抗菌性有待提高，故也可以考虑制备抗菌的n-HA纳米粒子，或考虑与具有抗菌性的高聚物复合制备成具有持久抗菌性的多孔材料用于骨组织工程支架材料。(4)由于n-HA基复合材料高度的多孔结构严重削弱了其力学性能及降解性能，因而应综合考虑其多孔结构、力学性能、降解性能等方面的平衡性，进一步优化复合支架的各种性能，使其满足临床应用的要求，为骨缺损病人带来新的治疗手段。