QuEChERS/HPLC测定土壤中4种酰胺类杀虫剂的残留

刘伶俐，索纹纹，徐飞良，黄向荣，万译文

(1.湖南省水产科学研究所，中国 长沙 410153;2.农业农村部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙)，中国 长沙 410153;3.湖南省饲料工业办公室，中国 长沙 410011;4.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，中国 常德 415000)

有机磷、有机氯等农药因具有高毒或剧毒而逐渐被各国所限用或禁用，且大量、频繁地使用这些农药也使害虫产生了抗药性[1]。土壤作为农药在环境中的蓄积地，其降解速度较慢，持续性、高浓度使用高毒农药可能会对水体、大气、农产品等产生不同程度的化学污染和残留风险，进而给食用者的健康带来潜在危害[2]，因此研究开发毒性低、高效且与环境相容性好的新颖杀虫剂，已成为国内外关注的焦点[3]。作为甲胺磷、马拉硫磷的替代品，低毒、高效的酰胺类杀虫剂(以氯虫苯甲酰胺[4]、氟虫双酰胺[5]、唑虫酰胺[6]及氟啶虫酰胺[7]为代表)在农业生产中大面积推广应用。但随着使用剂量的不断增大，杀虫剂与环境和农产品之间的安全问题就逐渐显现[8]，为此国际食品法典委员会、美国、日本、欧盟等均制定了国际公约、法规及限量标准，对合理科学使用农药、保护环境起到了积极的作用。但我国GB 2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留量》仅对唑虫酰胺的最大残留限量(MRL)进行了规定，对另外3种仅作了临时限量规定[9]。

目前，关于4种酰胺类杀虫剂的报道更多地集中于单个物质的残留分析检测[10，11]、降解动态研究[12-14]，分析方法主要有液相色谱法[6，13]、液相色谱-质谱法[10，11]。目前，采用同一种前处理方法及色谱检测条件测定土壤中4种酰胺类杀虫剂残留量的研究尚未见报道。本研究采用分散固相萃取(QuEChERS)净化结合HPLC法，同时测定土壤中氟虫双酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟啶虫酰胺、唑虫酰胺的残留量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

配备紫外检测器(UV)的LC-20型高效液相色谱仪(岛津公司，日本)；R-3平行蒸发器(布奇公司，瑞士)；Lab M64氮吹浓缩装置(北京莱伯泰科仪器股份有限公司，中国)，Z323K高速离心机(贺默公司，德国)；BX8200HP超声波清洗器(上海新苗医疗械制造有限公司，中国)；SHA82A 数显水浴恒温振荡器(金坛市品玻实验仪器厂，中国)。

氟虫双酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟啶虫酰胺、唑虫酰胺标准品(纯度≥97.0%，Dr公司，德国)，乙腈(色谱纯，默克公司，德国)，PSA(N-丙基乙二胺，粒径：40～63 μm)，C18硅胶(粒径：60～200 μm)，实验用水符合GB/T 6682中一级水的规定。

1.2 分析步骤及方法

1.2.1 样品提取及净化 准确称取筛分好的土壤样品10.00 g(±0.02 g)置于50 mL 锥形瓶中，加入20 mL乙腈，混匀后加盖超声提取10 min，再置于振荡器中提取24 h。将上清液全部转移至50 mL离心管中，在6 000 r·min-1下离心10 min。准确吸取10.00 mL上清液，将其转移到离心管或蒸发管中，在45 ℃下氮吹或蒸至近干。随后加入1.00 mL流动相、1.00 mL乙腈涡旋混匀以溶解残渣，并全部转移至10 mL离心管中。加入100 mg PSA和100 mg C18 混匀，6 000 r·min-1下离心5 min，上清液过0.22 μm滤膜，以供高效液相色谱仪进行测定。

1.2.2 色谱条件的设定 采用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm)，流动相采用乙腈-0.1 mol·L-1乙酸铵溶液等度洗脱，流速0.8 mL·min-1，进样量20 μL，柱温35 ℃，检测波长265 nm。

1.2.3 标准曲线的配制及绘制 分别准确称取氟虫双酰胺、氯虫苯甲酰胺、唑虫酰胺和氟啶虫酰胺的标准品适量，用乙腈稀释定容至100 mL，配制成浓度为100 mg·L-1的标准储备液，在-18 ℃下避光保存，有效期为6个月。分别准确移取标准储备液适量，并用乙腈稀释配制成0.05，0.1，0.5，1.0，5.0 mg·L-1的系列标准工作液，现配现用。采用标准溶液质量浓度(x，单位为mg·L-1)与峰面积(y)来进行标准曲线的绘制。

1.2.4 添加与回收 在未施过上述4种杀虫剂的土壤中添加氟虫双酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟啶虫酰胺标准溶液，其添加质量比分别为0.2，1.0，2.0 μg·g-1；在未施过上述4种杀虫剂的土壤中添加唑虫酰胺标准溶液，其添加质量比分别为0.4，2.0，4.0 μg·g-1。每个处理设计6次重复，以此计算添加回收率的平均值和相对标准偏差(RSD值)。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

有文献报道[15，16]，将氯虫苯甲酰胺、氟啶虫酰胺、氟虫双酰胺的标准溶液进行紫外光谱或DAD全波长扫描，在200～300 nm均有较好的紫外吸收，笔者对4种酰胺类杀虫剂的标准溶液进行210 nm和265 nm的紫外扫描，得到相应的紫外吸收光谱图(限于篇幅，以氟啶虫酰胺为例，见图1)。210 nm的色谱图中，乙腈溶剂峰的影响较为明显，并且干扰氟啶虫酰胺的出峰及定量；当选用265 nm作为检测波长时，4种物质均有较强的吸收峰，同时杂质响应值小、溶剂干扰较小、实验分析过程稳定，因此最终确定265 nm作为检测波长。

图1 土壤中不同波长氟啶虫酰胺色谱图Fig. 1 Chromatograms of different wavelengths of Flonicamie in soil

2.2 提取溶剂的优化

提取土壤中农药残留时多采用二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙腈或其组合等作为提取剂。覃国新等[17]的试验结果表明，用二氯甲烷做提取溶剂时，氟虫双酰胺的回收率低，用乙酸乙酯提取时效果较为理想；甲醇提取物基质复杂、样品中水分和干扰物难以净化，乙腈比乙酸乙酯极性大、分子小、提取能力更强。笔者以乙腈、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷为提取剂，比较其对土壤中4种杀虫剂的提取效果，结果见图2。经乙腈提取的氟啶虫酰胺和氟虫双酰胺的回收率均可达80%以上，氯虫苯甲酰胺和唑虫酰胺的回收率也在75%以上。乙酸乙酯作为提取剂，耗费大量的有机溶剂，对氟虫双酰胺的损失较大、回收率达不到要求；甲醇作为提取剂，杂质对目标峰有一定的干扰，唑虫酰胺丢失，不满足实验要求；二氯甲烷作为提取剂，提取液浑浊、杂质干扰明显，且氟虫双酰胺和唑虫酰胺的提取效果极低，均达不到实验要求。故最终选用乙腈作为土壤的提取剂，以确保目标物能被有效提取。

图2 土壤中4种提取剂色谱图Fig. 2 Chromatograms of four kinds of extractants in soil

2.3 净化条件的优化

土壤样品因其本身基质较为复杂，干扰因素较多，需要进行适当的净化处理才能排除干扰、获得较好的分离效果。土壤样品有多种净化方法，如固相萃取净化[18]、凝胶渗透色谱净化[19]等，但这些净化方法较为复杂、耗时长、成本高，现多采用QuEChERS方法或改进的QuEChERS方法进行样品的净化，依据不同的基质，灵活地选择萃取溶剂和吸附剂，以更为快速、经济、高效地净化样品[20-22]。本文对比了C18，PSA和炭黑的净化效果，试验结果表明，炭黑净化会导致唑虫酰胺回收率偏低或丢失；C18和PSA的净化效果较为理想，4种物质的回收率均在75%以上。C18和PSA加入量不同对4种物质回收率的影响结果见表1。随着C18和PSA用量的增加，其杂质含量降低、净化效果亦有所提升，但氯虫苯甲酰胺的回收率会降低。为保持良好的添加回收率并达到去除杂质的目的，笔者最终选用C18和PSA加入量均为100 mg的方案，其回收率均在80%以上，且杂质干扰较少。

表1 C18和PSA不同加入量对4种物质回收率的影响Table 1 The influence of different dosage of C18 and PSA on the recovery of four substances

2.4 流动相体积比对分离效果的影响

为了获得较好的对目标物质的保留分离效果及其响应，何旭峰等[2]对比了甲醇及乙腈与水的混合流动相，发现以乙腈为流动相时能得到较好的分离效果和较高的灵敏度，在此流动相中添加乙酸铵后，目标物质的峰型和响应更好。笔者选用乙腈-0.1 mol·L-1乙酸铵水溶液体系为流动相，按不同体积比(80∶20，60∶40，50∶50，40∶60，20∶80)进行比较试验。结果发现：当采用梯度洗脱时，目标物基线不平稳，氟虫双酰胺及唑虫酰胺出峰时间较晚，且峰形不对称，见图3；而采用等度洗脱时，4种物质的峰型均较尖锐，也无溶剂峰的干扰，出峰时间明显缩短，提高了检测效率。当乙腈和0.1 mol·L-1乙酸铵水溶液的体积比为60∶40时，4种物质的出峰时间较早、峰型较好、分离效果满足残留检测要求。

图3 不同洗脱方式下4种酰胺类物质色谱图Fig. 3 Chromatograms of four amides in different elution modes of mobile phase

2.5 标准曲线线性回归方程和灵敏度

按照1.2.3的方法进行标准工作液的配制，并按照上述色谱条件上机测定；以3倍和10倍信噪比(S/N值)分别确定土壤中4种物质的检出限(LOD值)和定量限(LOQ值)，其线性回归方程、相关系数、LOD和LOQ值见表2。各参数优化后，4种酰胺类物质在 0.05～5.0 mg·L-1范围内均具有良好的线性关系，其相关系数均大于0.999 9。实验得出氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和氟啶虫酰胺的LOD值均为0.20 μg·g-1，唑虫酰胺的LOD值为0.40 μg·g-1，此结果表明该方法适用于土壤中4种酰胺类杀虫剂的定量测定。

表2 4种物质的线性回归方程、相关系数、检出限及定量限Table 2 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and quantitative limits of four amide insecticides

2.6 方法准确度及精密度

以不含氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺、唑虫酰胺和氟啶虫酰胺的土壤样品为本底，氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺添加量为0.2～2.0 μg·g-1，唑虫酰胺添加量为0.4～4.0 μg·g-1，按照1.2方法进行回收率和精密度实验。从表3可以看出，土壤中氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和氟啶虫酰胺在0.2，1.0，2.0 μg·g-1时的回收率为96.7%～106%，RSD值为1.42%～2.60%；唑虫酰胺在0.4，2.0，4.0 μg·g-1时的回收率为88.2%～98.7%，RSD值为1.04%～1.16%，表明该方法回收率高、精密度好，适用于土壤中4种酰胺类杀虫剂的检测要求。

表3 空白土壤方法准确度和精密度结果(n=6)Table 3 Test results of accuracy and precision for the method from soil samples(n=6)

3 结论

本文建立了QuEChERS净化结合HPLC同时测定土壤中氯虫苯甲酰胺、氟啶虫酰胺、唑虫酰胺和氟虫双酰胺残留量的检测方法。本方法具有定量准确、重复性好、线性关系良好、精密度高等特点，适用于同时测定土壤中氯虫苯甲酰胺、氟啶虫酰胺、唑虫酰胺和氟虫双酰胺的残留量。