去离子甲酰胺在脑腱黄瘤病基因诊断中的应用

宫磊，张志坚，杨建课，高继光，戚之琳

(1. 皖南医学院医学生物学教研室，安徽 芜湖 241002；2. 皖南医学院医学生物化学教研室，安徽 芜湖 241002)

脑腱黄瘤病(cerebrotendinous xanthomatosis，CTX)是一种常染色体隐性遗传的脂质代谢性疾病。90%以上的病例是由于CYP27A1基因突变导致编码产物固醇27-羟化酶功能异常，继而引起胆酸合成障碍而发病，临床表现为多系统损害，如青少年白内障、肌腱黄瘤、早发性动脉硬化、进行性神经功能障碍等。通过基因检测早期明确诊断并采用鹅去氧胆酸治疗对于阻止或延缓病情发展具有重要的意义[1-3]。在对CYP27A1基因的检测中，我们发现由于其编码序列GC含量较高，进行PCR扩增时，很容易出现非特异性条带，不利于后续对PCR产物的测序分析。为提高PCR反应的特异性，我们采用了热启动PCR，并在反应体系中添加了去离子甲酰胺，以优化CYP27A1基因检测的方法，同时也为高GC比DNA片段的扩增提供方法上的参考。

1 资料与方法

1.1血液标本 健康人体外周血标本1例，肝素锂抗凝，-20℃冰柜冻存。

1.2研究方法

1.2.1主要仪器和试剂 Mastercycler Gradient PCR仪(Eppendorf公司)；血液基因组DNA提取试剂盒(Axygen公司)；去离子甲酰胺(上海生工生物工程公司)；热启动Taq酶(Takara公司)；DL2000 DNA Marker(Takara公司)；dNTPs(Takara公司)；PCR清洁试剂盒(Axygen公司)。

1.2.2DNA提取 将全血室温解冻后，使用血液基因组DNA提取试剂盒提取出基因组DNA。

1.2.3引物设计和合成 NCBI网站在线设计4对引物分别扩增CYP27A1基因4个片段，涵盖CYP27A1基因全部外显子以及外显子内含子接头处。引物序列、位置以及扩增片段的编号、大小、GC含量见表1。

表1 引物序列、位置以及扩增片段的编号、大小、GC含量

1.2.4不同浓度去离子甲酰胺条件下采用热启动PCR扩增CYP27A1基因目标片段 在反应体系中不含去离子甲酰胺和去离子甲酰胺浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的情况下扩增CYP27A1基因片段2；在不含去离子甲酰胺和去离子甲酰胺浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%的情况下扩增CYP27A1基因片段1、3、4。PCR总反应体积为50 μl，其中热启动Taq酶1.25 U，MgCl21.5mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上游及下游引物各0.25 μmol/L。PCR循环条件为：94℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s ，72℃延伸1 min 30 s，共40个循环，最后72℃延伸5 min。对PCR产物行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5去离子甲酰胺对PCR扩增效率影响的分析 采用Image J 软件分别测量不同去离子甲酰胺浓度条件下扩增出的4条目标带的光强度值。然后采用SPSS Statistics 20.0软件进行单因素方差分析，比较不同浓度下目标带的光强度值差异。

1.2.6测序分析 挑选4个目标带的特异性扩增产物，经PCR清洁试剂盒纯化后进行测序分析。

2 结果

2.1不同浓度去离子甲酰胺条件下CYP27A1基因的扩增结果

2.1.1片段2的扩增结果 在反应体系中不含去离子甲酰胺和去离子甲酰胺浓度为1%～8%时，均扩增出目标带，但浓度为7%和8%时，目标带明显减弱。浓度为9%和10%时，未扩增出目标带。在反应体系中不含去离子甲酰胺和去离子甲酰胺浓度为1%～3%时可见非特异性条带，浓度为4%～8%时，未见非特异性带。

2.1.2片段1、3、4的扩增结果 在反应体系中不含去离子甲酰胺和去离子甲酰胺浓度为1%～6%时，均扩增出目标带；在反应体系不含去离子甲酰胺时，扩增产物均存在非特异性带，当去离子甲酰胺浓度为3%～6%时，均未见非特异性条带，见图1。

注：图A：片段1的扩增结果；图B：片段2的扩增结果；图C：片段3的扩增结果；图D：片段4的扩增结果； M为DL2000 DNA Marker；图A、B、C、D中第1至第7泳道对应的去离子甲酰胺浓度均依次为0、1%、2%、3%、4%、5%、6%。

2.2不同去离子甲酰胺浓度条件下扩增产物中目标带光强度值的比较结果 经单因素分差分析，去离子甲酰胺浓度在0、1%、2%、3%、4%、5%、6%条件下扩增出的目标带光强度值无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 不同去离子甲酰胺浓度下扩增CYP27A1基因目标带的光强度值比较

2.3DNA测序结果CYP27A1基因4个目标带的特异性扩增产物经测序分析和NCBI 网站BLAST 比对验证为目标序列，见图2。

注：图A：片段1的测序结果；图B：片段2的的测序结果；图C：片段3的的测序结果；图D：片段4的的测序结果。

3 讨论

采用PCR扩增目标基因然后进行测序分析是基因检测或诊断中常用的一种简便而经济的方法。在使用PCR扩增高GC含量的DNA片段时，可能因为退火时模板易形成链内的二级结构而出现产量低、特异性低的问题[4-6]。由于甲酰胺能够减弱核苷酸之间的氢键，消除局部的二级结构，Sarkar G等[4]在扩增GC含量为55%的DRD2基因片段时，为了提高特异性，最先在PCR反应体系中加入甲酰胺，使其终浓度分别为1.25%、2.5%、5%、10%，结果发现甲酰胺浓度为5%时不仅提高了扩增的效率，而且完全消除了非特异性带，而当甲酰胺浓度为10%时，未扩增出目标片段。之后相继有学者报道一定浓度的甲酰胺可以提高高GC比片段扩增的效率和特异性，但不同研究结果所显示的甲酰胺在PCR反应体系中的最佳使用浓度存在差异，有3%、4%和5%[6-8]。Strien J等[9]在分别使用HotStarTaq 聚合酶、 DAp GoldStar○RDNA聚合酶、OneTaq○RDNA聚合酶并添加甲酰胺的情况下扩增 GC比分别为56%和82%片段时，未获得成功，因而不建议甲酰胺作为PCR添加剂时与这些酶联用。本研究在扩增CYP27A1基因4个高GC含量的片段时，为了提高PCR反应的特异性，在Mg2+浓度为1.5 mmol/L的情况下，首先采用了热启动PCR方法，结果均扩增出目标带，但4个目标带的扩增均见非特异性条带。为进一步提高反应的特异性，我们向反应体系中添加了不同浓度的去离子甲酰胺，结果发现扩增的特异性明显增强，当去离子甲酰胺的终浓度为4%、5%和6%时，4个片段的扩增均完全消除了非特异性带。为进一步了解去离子甲酰胺的浓度是否会影响目标带的扩增效率，我们采用了Image J软件测量反应体系中不含去离子甲酰胺以及去离子甲酰胺浓度为1%、2%、3%、4%、5%、6% 7种情况下4个目标条带的光强度值，比较不同浓度下目标带的光强度值差异，结果显示无明显差异，提示去离子甲酰胺浓度在6%及以下时，对热启动PCR的扩增效率无影响。而当我们将去离子甲酰胺的浓度增加至7%或8%来扩增CYP27A1基因片段2时，目标带明显减弱；增至9%或10%时，PCR反应完全被抑制，这一结果与Sarkar G等[4]在10%的甲酰胺浓度下未扩增出目标带以及Kovárová M等[7]报道的2M(相当于8%)的甲酰胺可导致PCR扩增效率下降90%相似。综合CYP27A1基因4个片段的扩增结果及已有的报道，我们认为采用热启动PCR，同时向反应体系中添加去离子甲酰胺能有效扩增出高GC含量的DNA片段，同时避免非特异性带的产生，但反应体系中去离子甲酰胺的浓度宜控制在4%～6%。这一方法不仅适用于脑腱黄瘤病的致病基因—CYP27A1基因的检测，也可用于其他富含GC的基因的检测。