广西壮族儿童ADAM33基因rs511898、rs44707位点多态性研究

杨丽娟，邓高，陆壮念，李沛隆，梁立婷，罗秀状，林娜

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院附属医院儿科，广西 百色 533000；3. 右江民族医学院附属医院肾内科，广西 百色 533000)

解整合素-金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloprotese 33，ADAM33)为锌依赖性金属蛋白酶ADAM家族的成员之一，属于1型跨膜酶原糖蛋白，位于染色体20p13.10的短臂上，长约14 kb，由21个内含子和22个外显子组成。其主要生物学功能包括细胞活化、蛋白水解、分子修饰和释放、信号传导等[1]。ADAM33主要在平滑肌细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞等间充质细胞表达，并在这些细胞中发挥作用，而在炎症细胞、上皮细胞中的表达较少。研究表明，ADAM33基因多态性与慢性阻塞性肺疾病、过敏性鼻炎等特异性疾病有关[2-4]，其在气道重塑及哮喘精准治疗中起着重要的作用[5-6]。本文主要研究ADAM33基因rs511898、rs44707这两个位点在广西壮族儿童中的分布特点并与其他地区民族或种族进行比较，为探讨ADAM33基因SNP的生物学功能及其与某些疾病的相关性提供更多依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2021年1月—2021年5月在右江民族医学院附属医院儿童保健科体检的健康儿童94例，其中男52例，女42例，平均年龄(5.29±2.29)岁，研究对象直系三代均为广西壮族人，相互之间无血缘关系。以上研究对象的家属和(或)监护人均知晓本研究，并自愿签署知情同意书。此研究已通过本单位的伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1DNA提取 用乙二胺四乙酸抗凝管收集研究对象外周静脉血2ml，使用离心柱型血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，在-80℃冰箱保存备用。

1.2.2引物设计 由上海捷瑞生物工程有限公司通过premier 6在线软件设计合成引物，扩增rs511898位点和rs44707位点的引物序列，见表1。

表1 扩增rs511898位点和rs44707位点的引物序列

1.2.3PCR扩增 总反应体积为15 μl，其中包含2 X CPR MIX 7.5 μl，正向引物0.3 μl，反向引物0.3 μl，模板DNA 1 μl，双蒸水5.9 μl。充分混匀，放入PCR扩增仪扩增。反应条件：94℃预变性3 min，按程序94℃ 20 s→ 58℃ 20 s→ 72℃ 40 s，重复35个循环，之后72℃修复延伸5 min。

1.2.4PCR产物纯化 总反应体积为7 μl，PCR产物3 μl，核酸外切酶I 0.2 μl，碱性磷酸酶FastAP 0.8 μl，核酸外切酶I buffer缓冲液 0.7 μl，双蒸馏水2.3 μl，置于37℃水浴锅15 min → 80℃水浴锅15 min。

1.2.5延伸反应 总反应体积为6 μl，PCR纯化产物2 μl，SNAPSHOT mix 1 μl，延伸引物(10 μM)0.2微升/条，双蒸馏水2.8 μl，按程序94℃ 10 s→ 52℃ 5 s→ 60℃ 30 s扩增30个循环。取1 μl产物，加9 μl上样HiDi，95℃变性3 min，立即冰水浴，上测序仪测序，测序结果用GeneMarker V 2.2.0软件对rs511898位点和rs44707位点进行分型分析。

1.2.6统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。ADAM33基因型及其等位基因用计数法计算频率，并进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验。计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1广西壮族儿童ADAM33 rs511898、rs44707位点的基因分型 分型检测结果显示rs511898存在3种基因型，分别为 CC、CT、TT，基因型峰型，见图1。rs44707存在3种基因型，分别为GG、GT、TT，基因型峰型，见图2。经Hardy-Weinberg平衡检验分析，两位点基因型均符合Hardy-Weinberg平衡，所选人群群体代表性好(P>0.05)，结果具有群体代表性。

注：rs511898延伸引物为反向延伸，产物为多态性的

注：A为GG基因型峰型；B为GT基

2.2广西壮族儿童ADAM33基因多态性分布 ADAM33基因rs511898位点在广西壮族儿童中以CC基因型最常见(52.13%)，C等位基因的频率最高(71.81%)，男女基因型及等位基因频率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。rs44707位点以GT基因型最常见(50.00%)，G等位基因的频率最高(62.23%)，男女基因型及等位基因频率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 广西壮族儿童ADAM33基因rs511898位点基因型及等位基因频率分布

表2 广西壮族儿童ADAM33基因rs44707位点基因型及等位基因频率分布

2.3广西壮族儿童ADAM33基因rs511898位点多态性与不同地区种族的比较 rs511898位点的基因型与中国南方汉族人及美国哥伦比亚人相比差异无统计学意义(P>0.05)，与非洲尼日利亚人、东亚日本人、南亚巴基斯坦人相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，rs511898位点等位基因分布频率除与中国南方汉族人差异无统计学意义外，与非洲尼日利亚人、东亚日本人、南亚巴基斯坦人及美国哥伦比亚人相比差异均有统计学意义(P均<0.05)，见表3。

表3 广西壮族儿童 rs511898基因型和等位基因分布频率与不同地区种族人群比较

2.4广西壮族儿童ADAM33基因rs44707位点多态性与不同地区种族的比较 广西壮族儿童ADAM33基因rs44707位点的基因型及等位基因分布频率与中国南方汉族人差异无统计学意义(P>0.05)，与非洲尼日利亚人、东亚日本人、南亚巴基斯坦人及美国哥伦比亚人相比差异有统计学意义(P<0.05)，rs44707位点等位基因分布频率除与中国南方汉族人差异无统计学意义外，与非洲尼日利亚人、东亚日本人、南亚巴基斯坦人及美国哥伦比亚人相比差异均有统计学意义(P均<0.05)，见表4。

表4 广西壮族儿童rs44707基因型和等位基因分布频率与不同地区种族人群比较

3 讨论

ADAM33已被证实与气道重塑有关，它是由转化生长因子-β诱导的胞外域脱落而产生的，具有促血管生成作用[7-8]。国内外研究表明，ADAM33与肿瘤的发生密切相关，Manica等[9]研究证实了ADAM33蛋白的缺乏或低表达可能会增加乳腺癌细胞的侵略和转移，其发生机制尚不明确。Stasikowska-Kanicka O等[10]发现了ADAM33在鼻窦倒置型乳头状瘤和喉鳞状细胞癌中过表达。张国华等[11]采用免疫组化染色和甲基化DNA免疫共沉淀-定量PCR法检测90例胆管癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织中ADAM33蛋白表达和基因甲基化程度，结果显示ADAM33蛋白在胆管癌组织中表达上调，其表达不受ADAM33启动子甲基化调控的影响，但与肿瘤分期、转移及预后有关。以上研究表明，ADAM33过度表达或低表达均可增加肿瘤发生的风险，部分肿瘤的发生推测可能与ADAM33的促血管生成作用有关。故可将ADAM33作为一种新型分子标志物，用于明确某些肿瘤的分型、治疗及预后判断。Feng HH等[12]通过荟萃分析探讨了ADAM33基因rs511898位点与COPD易感性之间的关系，结果显示ADAM33 基因rs511898位点突变基因A可能增加亚洲人群中COPD的风险。王莎莎等[13]采用SNaPshot SNP分型技术对新疆地区哈萨克族193例对照组及197例COPD病例组检测ADAM33基因各位点多态性，研究发现ADAM33基因rs511898多态性与可能与新疆哈萨克族人群COPD的发生有关。Li HF等[14]的荟萃分析亦表明亚洲人群中rs511898多态性的等位基因和基因型与哮喘易感性有关。Liang SQ等[15]在按种族进行的亚组分析的一项荟萃分析中也提及，ADAM33基因rs511898多态性仅在亚洲人中发现了阳性结果，而在欧洲或拉丁美洲则没有。由上述研究可推测ADAM33基因rs511898位点多态性可能是亚洲人群哮喘及COPD发病的危险因素。

本文通过对广西壮族儿童ADAM33基因rs511898和rs44707位点SNP分析，结果显示ADAM33基因rs511898和rs44707位点的基因型及等位基因频率在男女性别间比较均无差异，说明这2个位点基因型与等位基因分布可能与性别无关。通过与ensemble数据库公布的千人基因组计划中的数据进行比较，发现广西壮族儿童rs511898位点各基因型及等位基因的分布频率与非洲尼日利亚人、日本人、南亚巴基斯坦人相比，差异均有统计学意义，其基因型分布频率与美国哥伦比亚人相比，差异无统计学意义，而等位基因分布频率与美国哥伦比亚人相比，差异具有统计学意义；广西壮族儿童rs44707位点各基因型及等位基因的分布频率与上述4国家的人群比较均有统计学意义；两位点各基因型及等位基因的分布频率与中国南方汉人相比，差异均无统计学意义。以上结果表明，rs511898和rs44707位点SNP可能与种族和地域存在密切关系，广西壮族儿童与中国南方汉人同属一个种族，均生活在南方地带，亲缘关系较接近，故SNP差异不大，而与非洲尼日利亚人、东亚日本人、南亚巴基斯坦人亲缘关系较远，且生活的环境、地域、饮食、生活习惯均不同，故SNP差异较大，这亦符合生物多样性的遗传进化规律，而这种遗传进化可能导致某些疾病在特定人群或地域中的发病率增高。对于rs511898 C/T位点，广西壮族儿童的基因型与美国哥伦比亚人比较差异无统计学意义，其等位基因分布频率与美国哥伦比亚人相比，差异具有统计学意义，提示等位基因C可能是风险等位基因，这为后续探讨该位点与广西壮族儿童某些特定疾病的相关性提供了重要线索。