高效液相色谱法测定人造革中甲酰胺残留量

侯焕瑶，倪力军，栾绍嵘，张立国

（华东理工大学化学与分子工程学院，上海 200237）

引言

甲酰胺又称为氨基甲醛，是一种易引起过敏反应的有毒有害物质，对眼睛和皮肤有一定的刺激，吸入后对健康也有一定的危害，长时间暴露于甲酰胺还会影响中枢神经系统，是具有致畸、致癌，且具生殖毒性的物

质(CMR)[1-3]。在国外，欧盟将甲酰胺视为1B 类致癌物质，2012年欧洲化学品管理署(ECHA)将甲酰胺作为第7 批13 项高度关注物质(SVHC)。甲酰胺作为发泡剂，在人造革及相关发泡产品的生产中被用来增加产品的柔韧性，可以防止产品断裂并降低生产成本[4]。目前以人造革为原料或含有人造革的产品在日常生活中屡见不鲜[5-6]，其中残留的甲酰胺会对人类健康造成危害。因此，对发泡材料中残留甲酰胺进行检测、监控非常必要。

目前已有较多文献报道酰胺类溶剂的检测，但涉及甲酰胺溶剂残留量测定的并不多见[7-8]。在国家标准GB/T 34842-2017[9]中规定了鞋类及鞋类部位中发泡材料甲酰胺的化学试验方法，该标准中甲酰胺的测定用气相色谱-质谱法(GC-MS)，检出限为10 mg/kg，分析成本和检出限较高。欧盟玩具指令2009/48/EC 附件Ⅱ附件C 中规定泡沫玩具中甲酰胺的总释放量从测试开始至28 日之内不得超过20 ug/m3，这一检测方法耗时长，手续繁琐。目前较常见的甲酰胺检测方法为气相色谱-质谱法[10-13]、气相色谱法[14-15]，样品前处理通常是将样品经粉碎后先用溶剂多次超声提取。在某些检测皮革中酰胺类溶剂残留量的研究报道中，提取液还需经过固相萃取柱净化处理[16-17]，再通过氮吹或旋蒸浓缩提取液后再进行检测。这些甲酰胺残留检测方法中存在样品前处理复杂繁琐、易于造成甲酰胺的损失，影响测试准确度，或检出限偏高等问题。

本文研究中发现常规的溶剂（如丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯）难以充分提取人造革中的痕量甲酰胺，采用乙腈提取样品时甲酰胺的色谱峰面积最大，提取效率最好，进一步采用高效液相色谱（HPLC）方法进行分析，发现该分析方法甲酰胺的检出限比文献[17-20]报道的气相色谱-质谱联用法以及气相色谱法的检出限要低。该方法简便快速、灵敏度高、检出限低，为人造革、瑜伽垫等相关发泡材料中甲酰胺的测定提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 试剂和材料

甲酰胺标准品（纯度98.5%，上海梯希爱化成工业有限公司）；甲醇（色谱级，纯度≥90%，≤100%，默克股份两合公司）；乙醇（分析纯，纯度99.7%，上海泰坦科技股份有限公司）；乙酸乙酯（色谱级，纯度99.0%，上海阿拉丁试剂有限公司）；丙酮（分析纯，纯度99.5%，上海泰坦科技股份有限公司）；乙腈（色谱级，纯度≥90%，≤100%，默克股份两合公司）；0.22 um 有机过滤膜（泰坦科技股份有限公司）；人造革，橡塑保温材料，瑜伽垫以及EVC 地垫样品购于网络平台。

1.2 设备和仪器

AL-204 电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-200KDE 超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）；TU-1800PC T6 新世纪紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；UltiMate 3000 高效液相色谱仪（赛默飞科技有限公司）；7890B 气相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；7890A-5975C 气相色谱质谱联用仪（安捷伦科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取适量的甲酰胺标准品，用乙腈逐级稀释，配制成甲酰胺质量浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L 的系列标准工作溶液。

1.3.2 样品前处理

将待检测样品剪碎成粒径大小约2 mm，准确称样1.00 g，置于25 mL 具塞试管中，加入10 mL 提取溶剂，塞紧瓶塞，置于超声波发生器中水浴常温提取1 h，得待检测溶液，经0.22 um 有机滤膜过滤后，进色谱仪进行分析。

1.4 仪器工作条件

HPLC 条件：安捷伦ZORBAX SB-C18 色谱柱：4.6×250 mm 粒径5 um，进样体积为10 μL，柱温25℃，检测波长196 nm，0～5 min 采用等度洗脱法，5～35 min 时采用梯度洗脱法。洗脱时间为40 min，流速为1 mL/min，流动相A 为水，流动相B 为乙腈。0 min 时流动相组成为99%A+1%B，5 min 时99%A+1%B，10 min 时95%A+5%B，15 min 时85%A+15%B，20 min时75%A+25%B，25 min 时65%A+35%B，30 min 时55%A+45%B，35 min 时50%A+50%B。

GC 条件：色谱柱:Agilent J&W HP-INNOWAX(0.25 mm×30 m×0.25 μm)；载气：高纯氮气，体积流量1 mL/min，分流比10∶1；升温程序：起始温度为50 ℃，维持5 min，以每分钟20 ℃速率升至240 ℃，维持5 min；进样口温度为250 ℃，隔垫吹扫流量3 mL/min，压力：9.086 psi；检测器温度为270 ℃。

GC-MS 条件：Agilent HP-5 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）安捷伦科技有限公司；载气：He（纯度为99.999%）；流速：0.7 mL/min，5 min后0.57 mL/min；压力：4.0019 psi；分流进样，分流比10 ∶1；进样口温度250 ℃；隔垫吹扫流量3 mL/min；辅助加热器280 ℃；升温程序：初始温度50℃，保留4 min，以20 ℃/min 升至180 ℃，保持1 min，以20 ℃/min 升至280 ℃，保持10 min。电离方式：电子轰击离子源(EI)，电子能量70 eV；四级杆温度：150 ℃；离子源温度：230 ℃；扫描模式：SIM（m/z 45；m/z 44；m/z 29）；溶剂延迟2.5 min。

2 结果与讨论

2.1 检测器波长的选择

将甲酰胺标准品用乙腈作为溶剂配置成一定浓度的溶液后，在二极管阵列下扫描，以波长（nm）为横坐标，吸光度（Abs）为纵坐标绘制出甲酰胺紫外吸收光谱图，结果见图1。从图1 中可以看出，甲酰胺在196 nm附近具有最大吸收，因此，选择196 nm 为检测波长。

图1 甲酰胺标准品的紫外吸收光谱图

2.2 样品前处理条件的考察

2.2.1 萃取溶剂的选择

甲酰胺在常温下是一种无色无味的油状液体，当其含杂质时略有氨的气味，有吸湿性，几乎不溶于醚类或含氯溶剂，微溶于苯，能与水、甲醇、乙醇、丙酮和低级酯混溶。本文实验过程中，分别考察了甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈为提取溶剂时，相同人造革样品在同一色谱条件下的高效液相色谱图见图2，不同溶剂制备的供试品溶液中甲酰胺的含量见表1。当甲醇作为提取溶剂时，受人造革样品中其他物质的干扰，甲酰胺不能得到良好分离，无法准确地对甲酰胺进行定性及定量分析；由图2 可知，用乙腈、丙酮、乙醇、乙酸乙酯为提取溶剂时，在保留时间2.68 min 附近出现了甲酰胺色谱峰，但色谱峰的峰面积为乙腈＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醇，表明乙醇和乙酸乙酯对人造革中残留甲酰胺的提取效率不及乙腈。乙腈作为提取溶剂提取人造革时不仅可以得到峰形较佳的色谱峰，而且受样品杂质干扰小，提取效率高，故选择乙腈作为提取溶剂。

表1 不同提取溶剂的高效液相色谱分析结果Tab.1 Results of HPLC analysis with different extraction solvents

图2 不同溶剂提取的供试品溶液的高效液相色谱图

2.2.2 超声提取时间的考察

以乙腈作为提取溶剂，将人造革样品采用1.3.2所述步骤制备供试品溶液，采用1.4 节中所述HPLC法考察超声20、30、40、50、60、90、120 min 时，溶液中甲酰胺含量，结果如图3 所示。从图中可以看出，随着超声时间的增加，甲酰胺含量随之增加，但达到一定时间后，溶液中甲酰胺含量趋于稳定。因此，超声时间定为60 min。

图3 不同超声时间下测得的甲酰胺含量

2.3 线性关系、方法检出限和定量限

取1.3.1 节中配制的系列标准溶液用1.4 所述HPLC 条件进行测定，绘制标准工作曲线，在0.1～1.6 mg/L 的范围内，线性回归方程为y= 0.4743x+0.00005，相关系数R2为0.9999，可见甲酰胺在本实验的浓度范围内线性关系良好，按3 倍和10 倍的信噪比分别确定方法的检出限和定量限，方法的检出限和定量限分别为0.11 mg/kg 和0.36 mg/kg。

2.4 加标回收率和精密度

对含有甲酰胺的人造革样品进行加标回收率实验，称取人造革样品1.00 g，在9 份平行样品中分别进行81%，101%，122%三个水平添加，每个添加水平进行3 次平行试验，回收率见表2，由表2 可知，用乙腈浸提甲酰胺的平均回收率在83.4%～85.7%之间，相对标准偏差（RSD）在0.28%～0.93%之间。称取6份人造革样品，每份1.00 g，分别添加10 mL 乙腈作为提取溶剂，超声1 小时后用高效液相色谱仪进行检测，得到的重复性实验结果见表3，由表3 可知，重复性实验的相对标准偏差（RSD）为2.45%。

表2 加标回收实验结果（n=3）Tab. 2 Experimental results of labeled recovery (n=3)

表3 重复性实验结果（n=6）Tab. 3 Reproducibility test results (n=6)

2.5 不同检测方法的比较

以乙腈为提取溶剂，将人造革样品按照1.3.2节所述步骤制备供试品溶液，用1.4 节中所述HPLC法进行检测，得到的HPLC 谱图如图4 所示，测得人造革样品甲酰胺的含量为2.1 mg/kg。随后又将供试品溶液分别用GC 和GC-MS 联用法检测，无法得到相应的色谱峰。文献[17]中建立的超声萃取/气相色谱-质谱联用法同时测定皮革中21 种有害有机溶剂残留量，甲酰胺的检出限为0.09 mg/L；文献[18]建立的气相色谱-质谱法测定瑜伽垫中甲酰胺残留量，检出限为0.03 mg/L；文献[19]建立的气相色谱-质谱法法分析EVA 泡沫拼图地垫中的甲酰胺，检出限为1.5 mg/L；文献[20]建立的儿童地垫中甲酰胺的气相色谱测定法中，甲酰胺的检出限为0.5 mg/L。以上方法对甲酰胺的检出限均高于本文建立方法的检出限0.011 mg/L。

图4 人造革中残留甲酰胺的HPLC 谱图

2.6 其他产品中甲酰胺残留量的检测

以乙腈为提取溶剂，将塑保温材料、瑜伽垫、地垫等样品按照1.3.2 节所述步骤制备供试品溶液，用1.4 节中所述HPLC 法进行检测，得到的HPLC谱图如图5 所示，另建立10～240 mg/L 浓度范围内的标准工作曲线对其进行定量分析，测得三种样品甲酰胺的含量见表4。从检测结果中可知，三种材料中甲酰胺的残留量均远远高于人造革，其中EVC 地垫中甲酰胺的残留量可达2166.8 mg/kg。

图5 三种样品中残留甲酰胺的HPLC 谱图

表4 三种样品中残留甲酰胺的高效液相色谱分析结果Tab.4 Determination of residual formamide in three samples by HPLC

3 结论

以乙腈为提取溶剂，超声提取60 min，可有效提取人造革中的痕量甲酰胺。本文建立的甲酰胺HPLC 测试方法采用紫外检测器，可得到峰形较佳的甲酰胺色谱峰，对甲酰胺的检测具有较高的灵敏度。该方法样品前处理简便快速、检出限低、可准确测定样品中高于0.36 mg/kg 的甲酰胺残留量。该分析方法不仅可用于人造革中痕量甲酰胺的检测，也可推广应用于橡塑保温材料、EVC 地垫和瑜伽垫等甲酰胺含量较高材料的检测，为含发泡剂产品的质量检测提供了新的高效、简便的分析方法。