当归四逆汤中细辛的药效成分及其毒性研究Δ

余玖霞，梅 茜，许金国，苏联麟，毛春芹，谢 辉，陆兔林#

(1.南京市江宁中医院药学部，南京211100； 2.南京中医药大学药学院，南京 210046)

当归四逆汤在国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录(第一批)》中居第13首[1]。该方出自《伤寒论》，组成有当归、桂枝、白芍、细辛、甘草、木通和大枣，原文记载，“手足厥寒，脉细欲绝者，当归四逆汤主之”和“下利脉大者，虚也，以强下之故也。设脉浮革，因尔肠鸣者，属当归四逆汤”。该方具有温经散寒、养血通脉等作用，在临床被用于痛经、类风湿关节炎和糖尿病周围神经病变等疾病[2-8]。现代药理学研究结果表明，当归四逆汤中的细辛除镇痛、抗炎、止咳和平喘等基于传统功效药理活性外，还有抗病毒、抗菌、镇静、抗氧化、抗抑郁、降压和抗肿瘤等作用，其止痛机制可能与热敏通道瞬时感受器电位香草酸受体1(TRPV1)被激活有关[9-11]。课题组前期研究结果表明，细辛是当归四逆汤中重要的物质基础[2]。历代部分本草记载细辛“有小毒”，现代研究结果认为其毒性与剂量有关[12-13]。目前尚未见针对当归四逆汤中细辛的药效成分及毒性的相关报道。本研究通过建立细辛饮片的水煎液及当归四逆汤的指纹图谱，指认细辛有效成分，并结合小鼠急性毒性试验验证细辛及其复方的安全性，为进一步研究当归四逆汤中细辛的作用机制及相关制剂开发提供参考。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级雄性ICR小鼠，购自南京市青龙山动物养殖场，许可证号为SCXK(浙)2019-0002。

1.2 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；ZYX0071型超纯水系统(南京汉隆实验器材有限公司)；TD5001C型电子天平(天津天马衡基仪器有限公司)；MS-105D型十万分之一电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；H1650-W型台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；KQ-500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MG-H21S011型多功能电陶炉(广东美的生活电器制造有限公司)；2.1 L砂锅(江西舒雅陶瓷有限公司)。

1.3 药品与试剂

当归四逆汤的药材均购自道地产区或主产区，每味药收集至少3个产地，总批次至少15批，前期研究[2]已确定优质产地，并经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定确定基源；根据《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准的申报资料要求(征求意见稿)》，按照《中华人民共和国药典：一部》(2020年版)将药材炮制成合格饮片，随机组成当归四逆汤样品23批；原料信息见表1。甲醇(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)；乙腈(色谱纯，默克股份两合公司)；磷酸(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；其他试剂均为分析纯；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

表1 当归四逆汤药材来源Tab 1 Source of the medicinal materials of Danggui Sini decoction

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；

流动相：乙腈-0.05%磷酸水溶液(梯度洗脱，0～3 min，5%乙腈；3～10 min，5%～10%乙腈；10～15 min，10%～12%乙腈；15～30 min，12%～14%乙腈；30～35 min，14%～17%乙腈；35～40 min，17%～19%乙腈；40～50 min，19%～25%乙腈；50～75 min，25%～45%乙腈；75～90 min，45%～70%乙腈；90～92 min，70%～95%乙腈；92～95 min，95%～5%乙腈)；体积流量：1.0 mL/min；检测波长：245 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2 供试品溶液的制备

课题组经前期研究已得15批细辛饮片水煎液、23批当归四逆汤和1批缺细辛阴性水煎液，分别取上述液体3 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，称定重量，超声处理，放冷，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得细辛饮片供试品溶液、当归四逆汤供试品溶液和阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

课题组前期研究已做方法学考察[2]，结果表明，仪器精密度良好，该方法重复性良好，供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 细辛饮片指纹图谱的建立

取15批细辛饮片供试品溶液按色谱条件进行测定，记录色谱图。通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A)软件，以S1为参照峰，采用平均数法，进行多点校正和色谱峰匹配，得到细辛饮片高效液相色谱(HPLC)指纹图谱叠加图，共确认11个色谱峰，见图1—2。

图1 细辛饮片水煎液HPLC指纹图谱Fig 1 HPLC fingerprint spectrum of asarum water decoction

图2 细辛饮片水煎液HPLC指纹图谱共有模式图Fig 2 The common pattern of HPLC fingerprint spectrum of asarum water decoction

2.5 细辛饮片指纹图谱的相似度评价

通过评价系统软件，计算指纹图谱相似度，结果显示，15批细辛饮片指纹图谱相似度均>0.90，表明同产地不同批次细辛药材炮制得到的细辛饮片主要物质群相似度较高，细辛饮片质量稳定均一，见表2。

表2 15批细辛饮片水煎液HPLC指纹图谱相似度Tab 2 Similarity of HPLC fingerprint spectrum of 15 batches of asarum water decoction

2.6 当归四逆汤样品指纹图谱的建立

取23批当归四逆汤供试品溶液按色谱条件进行测定，记录色谱图。通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A)软件，以S1为参照峰，采用平均数法，进行多点校正和色谱峰匹配，得到当归四逆汤指纹图谱叠加图相似度均>0.90，可见其主要物质群相似度高、稳定性好，其中细辛的药效成分也在复方中有所体现，可进一步对细辛饮片和当归四逆汤的相关性进行研究确定。23批当归四逆汤样品共有模式图结果见图3。

2.7 细辛饮片、细辛饮片阴性制剂与当归四逆汤样品相关性研究

取细辛饮片供试品溶液、当归四逆汤供试品溶液和阴性对照溶液进行测定，记录色谱图。分别将上述供试品溶液的色谱图进行叠加比较，分析当归四逆汤样品指纹图谱的色谱峰归属。当归四逆汤样品指纹图谱中共有7个峰来自细辛饮片，采用混合对照品指认了其中2个成分：4号峰阿魏酸、23号峰细辛脂素，见图4。推测包括阿魏酸、细辛脂素在内的这7个成分是当归四逆汤中细辛发挥药效的活性物质群。

图4 当归四逆汤样品、细辛饮片水煎液和细辛饮片阴性水煎液色谱图Fig 4 Chromatograms of sample of Danggui Sini decoction, asarum water decoction and negative asarum water decoction

2.8 当归四逆汤及细辛饮片单煎急性毒性试验

取禁食(不禁水)12 h的雄性ICR小鼠42只，体重20～22 g，随机均分为细辛单煎组、复方组，每组21只。单煎组小鼠以最大浓度0.978 4 g/mL，最大给药剂量0.5 mL/10 g灌胃给药；复方组小鼠以最大浓度0.622 8 g/mL，最大给药剂量0.5 mL/10 g灌胃给药，均1日2次。连续观察2周，记录受试小鼠活动、行为及死亡等情况，死亡小鼠及时进行尸检。实验结束后，对所有小鼠进行大体解剖，观察心、肝、脾、肺及肾等脏器和组织的体积、颜色和质地等变化，并拍照称重。

按上述剂量灌胃给药的小鼠，在给药后当日均见活动减少，粪便棕褐色、质地较软但成形，次日恢复正常。小鼠体重增长正常，毛色、肤色和呼吸正常，鼻、眼及口腔未出现异常分泌物，2周内未见死亡。实验结束后经大体解剖，肉眼见心、肝、脾、肺及肾等脏器和组织在体积、颜色和质地等方面无异常改变，小鼠体重见图5—6。故当归四逆汤1日2次灌胃给药的小鼠最大给药量为31.14 g/kg，细辛单煎组1日2次灌胃给药的小鼠最大给药量为48.92 g/kg。

A.体重；B.脏器重量A. weight; B. weight of organs

A.体重；B.脏器重量A. weight; B. weight of organs

3 讨论

经典名方的开发研究要求从药材源头对其进行质量控制及溯源分析，本实验通过对当归四逆汤中细辛饮片、当归四逆汤样品指纹图谱进行研究，从饮片到当归四逆汤样品的物质群进行分析，对当归四逆汤中细辛的药效成分进行初步确定，通过相关性研究，对其进行整体化、过程化的质量控制。HPLC指纹图谱符合中医药整体性的特点，能较全面地反映所含成分信息，尤其适用于多成分、多靶点的中药分析，可较好地体现中药成分的复杂性和相关性，在中药质量控制、有效成分研究和作用机制研究等多方面发挥重要作用[14-15]；能够全面表征中药及制剂的整体化学信息，适用于阐释经典名方“药材-饮片-方剂”传递规律。课题组前期研究结果发现，当归四逆汤原料药材细辛及其饮片均指认14个色谱峰，根据色谱峰峰形及位置可知细辛主要药效物质群在炮制过程中未造成丢失，其药效物质群可以较好地从药材传递到饮片。本研究结果表明，当归四逆汤细辛饮片的水煎液指纹图谱与对照指纹图谱相似度>0.90，表明同产地不同批次细辛饮片的主要物质群相似度较高。当归四逆汤样品指纹图谱共确认25个色谱峰，其中1号峰、4号峰、19号峰、20号峰、23号峰、24号峰和25号峰归属于细辛饮片，经对照品指认出4号峰为阿魏酸、23号峰为细辛脂素，说明当归四逆汤中细辛的物质群可追溯到饮片。结合当归四逆汤饮片、样品指纹图谱研究和共有峰归属研究，7个色谱峰归属于细辛，占当归四逆汤样品总峰面积的14.61%。综上所述，当归四逆汤制备工艺较合理，其中细辛饮片的主要药效物质群能够从“药材-饮片-方剂”逐级进行传递，且物质群归属关系清晰明确。

自古有“细辛不过钱”的说法。现代研究结果证明，细辛含有的马兜铃酸Ⅰ具有肾毒性、致癌和致肝损伤等作用，因此使用前需对马兜铃酸Ⅰ进行限量检测，检查合格后的细辛药材经炮制加工成饮片。历代关于细辛的炮制方法有净制、切制、加热炮制及加辅料炮制等，而现代炮制方法相对单一。近年来研究结果表明，炒制、碱制、酒制和低温超微粉碎等方法可有效降低细辛毒性，增强临床应用安全性[16]。利用小鼠进行急性毒性试验能够确定中毒作用方式及反应，为亚急性毒性试验观察指标、剂量分组等提供参考[17-18]；至今仍被广泛用于测试各种毒性中药的作用，如钩藤碱[19]、新鲜唐古特大黄茎[20]和枸杞子[21]等。本研究对小鼠进行了1日2次灌胃给药的最大给药量试验(当归四逆汤组为31.14 g/kg、细辛单煎组为48.92 g/kg)，给药后2周内均未见小鼠有明显异常情况和死亡，实验结束后经大体解剖，肉眼见心、肝、脾、肺及肾等脏器和组织在体积、颜色和质地等方面无异常改变。若当归四逆汤按1 868.4 g细辛生药量/60 kg(即31.14 g/kg)计算，则小鼠剂量为临床用量的622.8倍[(1 868.4 g/kg)/(3 g/60 kg)]；细辛单煎按2 935.2 g生药量/60 kg(即48.92 g/kg)计算，则小鼠剂量为临床用量的978.4倍[(2 935.2 g/60 kg)/(3 g/60 kg)]，表明当归四逆汤、细辛临床应用安全性较高。