食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM能力验证结果分析与讨论

周 露

（宝应县产品质量综合检验检测中心，江苏扬州 225800）

微生物污染引起的食源性疾病是世界各国普遍关注的问题。大肠埃希氏菌O157:H7/NM是一种通过肉类或乳类食品传播的致病性大肠杆菌，这类病菌不仅能引起食物中毒，还能引起肠道内出血，因此又被称为“出血性大肠杆菌”。对食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM的检测和监控是预防与控制食源性疾病的重要技术手段。本实验室参加了大连中食国实检测技术有限公司组织的大肠埃希氏菌O157:H7/NM检测能力验证活动。

目前，能力验证已成为中国合格评定国家认可委员会保障实验室认可有效性极为重要的手段[1]。对于实验室而言，能力验证是非常有效的外部质量控制方式，利用能力验证结果能有效提升检验人员的检测能力及实验室检测水平。完成能力验证的过程能核验仪器设备的准确性、稳定性，验证检验人员的技术能力，能力验证结果可证明实验室已具备一定的技术能力。同时，每参加一个能力验证项目，都能提升实验室检验人员的技术水平，为以后的实验室现场评审和各项检查提供有力的证据。因此，实验室应加强开展能力验证活动，结合检验工作自身需求和能力验证领域及频次要求，积极寻求并主动参加能力验证和实验室间比对，覆盖能力范围内的专业领域，以满足CNAS能力验证规则的 要求。

1 材料与方法

1.1 检验依据

《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》（GB 4789.36—2016）[2]和大连中食国实检测技术有限公司《食品中大肠埃希氏菌O157:H7的测定能力验证计划作业指导书》（CFAPA—1190）。

1.2 材料与设备

1.2.1 仪器

电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；高压蒸汽灭菌器（日本株式会社平山制作所）；电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；法国AES均质器（法国AES仪器有限公司）；超纯水机（Thermo Fisher SCIENTIFIC 公司）；数显恒温水浴锅（金坛市荣华仪器制造有限公司）；显微镜（德国LEICA）；酸度计（北京赛多利斯仪器有限公司）；暗箱式紫外分析仪（上海宝山顾村电光仪器厂）；超低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）；药品保存箱（青岛Haier）；二级生物安全柜B2（新加坡ESCO）。

1.2.2 试剂

改良EC肉汤（mEC＋n）；改良山梨醇麦康凯琼脂（CT-SMAC）；三糖铁琼脂（TSI）；营养琼脂；半固体琼脂；月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG（MUG-LST）；氧化酶试剂；革兰氏染色液；大肠埃希氏菌O157:H7/NM生化鉴定试剂盒。

1.2.3 菌种

大肠埃希氏菌（ATCC 25922）、大肠埃希氏菌O157/H7（NCTC 12900），均购自广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心。

1.2.4 样品

大肠埃希氏菌O157:H7能力验证样品是添加特定菌株的乳粉冷冻干燥样品，共3瓶，瓶号分别为349、143和142。样品由大连中食国实检测技术有限公司提供。

1.3 试验方法

1.3.1 增菌

根据组织方作业指导书要求，样品前处理按照作业指导书进行，从冰箱中取出样品后，待样品达到室温时方可开启使用。西林瓶中处于高真空状态，开启时应按照要求。样品中含有活微生物，不可直接用手接触西林瓶内样品，从开启样品到测试结束均按照无菌操作进行，在生物安全柜内将大肠埃希氏菌O157:H7样品的西林瓶打开，立即加入少量（2～4 mL）生理盐水稀释液进行再水化，稀释液合计40 mL，待溶解后，吸出放入无菌三角瓶中，反复用剩余的生理盐水稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述的无菌三角瓶中，此溶液即是待测样品原液（该40 mL液体即为待测原液，即100），全过程在20 min内完成。取25 mL待测液加入含有225 mL mEC＋n肉汤的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1 min，充分匀质混匀。依此方法，分别对3件样品进行处理。同时按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》（GB 4789.36—2016）作阳性对照实验。上述增菌液在36 ℃环境下培养24 h。

1.3.2 分离

取增菌后的mEC＋n肉汤，划线接种于CTSMAC平板和大肠埃希菌O157显色琼脂平板上， 36 ℃培养24 h，观察菌落形态。在CT-SMAC平板上，典型菌落为圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色；在大肠埃希菌O157显色琼脂平板上呈现紫红色菌落。结果显示，349、142在CTSMAC平板及大肠埃希菌O157显色琼脂平板上均无可疑菌落，143及标准菌株均有典型菌落生长。

1.3.3 初步生化试验

从CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157:H7显色琼脂平板上分别挑取5～10个可疑菌落，分别接种TSI琼脂，同时接种MUG-LST肉汤，并用大肠埃希氏菌（ATCC 25922）作阳性对照和大肠埃希氏菌O157/H7（NCTC 12900）作阴性对照，于36 ℃培养24 h。同时进行氧化酶和革兰氏染色。在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈黄色，产气，不产硫化氢。置MUG-LST肉汤管于暗箱式紫外分析仪下观察，MUG阳性的大肠埃希氏菌有荧光产生，MUG阴性的无荧光产生，大肠埃希氏菌O157:H7/NM为MUG试验阴性，无荧光。

1.3.4 鉴定

挑取可疑菌落，在营养琼脂平板上分纯，于 36 ℃培养24 h，并进行鉴定。①血清学试验。在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落，用O157和H7诊断血清作玻片凝集试验。②生化试验。自营养琼脂平板上挑取菌落，进行生化试验。

2 结果与分析

2.1 初步生化试验

TSI、MUG-LST、氧化酶和革兰氏染色结果见表1。

表1 TSI、MUG-LST、氧化酶和革兰氏染色结果

2.2 血清学和生化试验鉴定结果与分析

①血清学试验。在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落，用O157和H7诊断血清作玻片凝集试验。143号及标准菌株在O157:H7血清上均凝集。②生化试验。自营养琼脂平板上挑取菌落，进行生化试验，结果见表2。综合生化和血清学试验结果，得知编号143的样品检出大肠埃希氏菌O157:H7，其余2个样品均未检出大肠埃希氏菌O157:H7。

表2 营养琼脂平板上可疑菌落生化结果

3 结论与讨论

本次能力验证在规定时间内提交结果，结果为满意。通过此次试验总结出以下经验。①能力验证工作较为复杂，对检测人员的操作水平和检测经验要求极高[3]。因此，要提前熟悉检测标准，准备好仪器设备，购买相关试剂，确保满足检测需求。②在试验过程中应注意，收到样品后立即按要求于 -18 ℃冷冻保存，准备开展检测时，把样品从冰箱取出后，待样品达到室温方可开启使用，以防止出现假阴性。③确保能力验证的培养基试剂、菌株的质量[4]。对培养基试剂、菌株按要求进行全面的性能测试，避免因培养基试剂质量问题导致结果偏差。④定性样品中含有一些与目标菌生化特征相似的背景菌，检测中在挑取可疑菌落时应按标准要求挑取足够的可疑菌，避免没有选中正确的阳性菌落，造成假阴性结果。⑤进行生化试验时，对照生化鉴定试剂盒的说明书严格操作，注意赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶应用石蜡封层培养。不同的生化试验管培养温度及时间有差异，培养过后还要进一步滴加试剂，及时观察结果并记录。⑥检测结束后，对所有使用过的玻璃器皿、增菌液、平板和生化试验管等及时进行无害化处理，避免交叉污染[5]。

综上所述，通过能力验证可充分了解检测过程中存在的不足，因此实验室应积极参加外部质量控制活动，注重能力验证活动的开展，逐步提升实验室的技术水平，增强样品检测过程中的质量意识。