基于转录物组学的大肠杆菌血红素过氧化物酶EfeB的生理功能解析

刘 琪， 刘海峰， 冯超群， 王 悦， 张 鑫， 卢 杰， 唐 蕾,*

(1)江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2)江南大学生物工程学院， 江苏 无锡 214122)

血红素过氧化物酶是以血红素为辅因子的氧化还原酶类，普遍存在于动物、植物和微生物中，借助H2O2催化多种有机或无机化合物的单电子或双电子氧化反应，因此具有重要的生理功能和应用价值[1]。血红素过氧化物酶根据基因序列和结构的不同，分属于不同的超家族，其中经典的有过氧化物酶-过氧化氢酶超家族、过氧化物酶-环氧化酶超家族等。1999年Kim和Shoda从白地霉(Geotrichumcandidum)中纯化和定性了一类新型血红素过氧化物酶[2]，其与已知的血红素过氧化物酶缺乏同源性，并且具有良好的染料脱色能力，因此被归类为染料脱色过氧化物酶(dye-decolorizing peroxidase, DyP) 超家族[3]。之后的研究相继在细菌、霉菌等不同的微生物中分离获得了更多的DyP，根据PeroxiBase分类系统，进一步将其分为A、B、C、D四大类[4]。鉴于其在降解酚类、蒽醌类、偶氮类及木质素模型化合物中的特性，对DyP的研究多聚焦于酶学性质，基因工程改造提高重组酶的活性[5, 6]，以及在合成染料脱色、纸浆工业中木质素和纤维素的降解，农业废弃物处理等方面的应用[7, 8]，而对其在微生物体中的生理功能缺乏深入的研究。

大肠杆菌(Escherichiacoli)作为模式菌株，遗传背景清晰，是重要的基因工程宿主之一，其EfeB蛋白是较早发现的DyP之一[9]。EfeB存在于E.coli周质中，属于A类DyP。Létoffé等指出，EfeB可在不破坏血红素卟啉结构的情况下，将血红素中的铁转至胞内[10]，丁亮亮等提出，EfeB可参与胞内氧化应激反应[11]。鉴于目前对大肠杆菌EfeB其他生理功能的了解十分有限，本研究通过构建E.coliBL21的efeB敲除菌株，比较出发菌株BL21和敲除菌株在基因组转录水平、不同条件下的细胞生长状况上的差异及对环境中Fe2+的应答作用，更全面地探究EfeB的生物学意义。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所用的菌株和质粒如Table 1所示。

Table 1 Strains and plasmids used in this study

培养基为：LB培养基(胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L)和M9培养基(磷酸氢二钠12.8 g/L，磷酸二氢钾3.0 g/L，氯化钠0.5 g/L，氯化铵1.0 g/L，葡萄糖4.0 g/L，七水合硫酸镁0.592 g/L，六水合氯化钙0.0219 g/L)。

1.2 仪器

凝胶成像仪、核酸电泳仪(美国Bio Rad公司)；实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统有限公司)；-80 ℃超低温冰箱(青岛海尔特种电气有限公司)；核酸紫外分析仪ZF-1B(汉诺仪器有限公司)；SW-OJ-1FD超净工作台(苏净集团安泰公司)；高压灭菌锅(致微仪器有限公司)；恒温摇床(太仓市强乐实验设备有限公司)。

1.3 培养方法

将各菌株接种到LB或M9液体培养基中，于37 ℃、200 r/min摇床过夜活化后，以2%的接种量转接至新鲜培养基中，37 ℃、200 r/min摇床培养，含质粒的菌株添加终浓度为50 mg/L的硫酸卡那霉素。需添加诱导剂的菌株，在培养至A600=0.6～0.8时，加入终浓度 0.2 mmol/L的IPTG诱导6 h。

1.4 生长曲线测定

将各菌株于37 ℃、200 r/min过夜活化，次日以2%的比例转接于50 mL的新鲜LB培养基中。每间隔2 h取样，设置3个平行，测定菌液在600 nm下的吸光度值，共测定12 h。

1.5 实时荧光定量PCR

将转接培养至对数生长期后的菌悬液，于10 000g、4 ℃下离心5 min收集菌体，用 50 mg/mL 的溶菌酶37 ℃破壁30 min，再按照RNA提取试剂盒(TaKaRa有限公司)说明书的要求提取总RNA。

使用核酸定量仪测定RNA浓度及纯度，将RNA反转录成cDNA保存。以上述cDNA为模板，采用Table2所示的引物，以SYBR® Green I嵌合荧光法进行定量PCR分析，选择编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因gapA作为内参基因，设置3组平行，使用相对定量Ct值的方法进行数据分析，以-ΔΔCt表示基因的差异表达水平。

Table 2 Primers for fluorescent quantitative PCR

1.6 转录物组测序

活化转接培养efeB基因敲除菌EcoΔefeB和出发菌株BL21，收集对数生长后期的菌体，立即进行液氮速冻处理，委托苏州金唯智公司完成测序，设置2个生物学重复，测序得到的原始数据进行质量分析和过滤后，采用DESeq2、Bowtie2、Htseq和Bioconductor软件进行生物信息学分析。转录物组基因差异表达分析的水平以Log2FoldChange表示。

1.7 统计学方法

数据通过SPSS 26进行统计学分析，对菌株的生长曲线和efeB基因在不同培养条件下的表达量进行单因素方差分析，每组实验设置3个生物学重复。P值<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 缺失efeB对大肠杆菌转录物组水平的影响

以NCBI上公布的E.coliBL21基因组作为参考序列，将过滤后的测序Clean Data与参考基因组进行比对分析，比对率均达到了99%以上，Pearson相关系数大于0.97，数据可靠。efeB基因的缺失导致其菌体内1 765个基因差异表达，其中上调基因为867个，下调基因为898个(Fig. 1)。

Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes (DEGs) DEGs were analyzed by DESeq2. Red dots indicate significantly up-regulated gene, and green dots indicate significantly down-regulated genes. Abscissa represents the change of gene expression fold in different samples, and ordinate represents the statistical significance of the change of gene expression. The difference significance criterion was that the expression of differential genes changed more than two folds and P<0.05

Fig.1的纵坐标为调整后的Pvalue，其值越大表示差异越显著。进一步选取表达差异明显的4个基因，即编码鞭毛钩相关蛋白质的flgK基因，编码鞭毛基体P环生物合成蛋白的flhA基因，ABC型Fe2+肠杆菌素转运系统基因fepB和efeB进行荧光定量PCR检测，并与转录物组数据进行比对，对转录物组数据的可信度进行验证，结果正如Fig.2所示：flgK和flhA的表达显著上调，基因fepB和efeB的表达明显下调，相对转录水平的趋势与RNA-seq的结果一致，数值在误差范围内，说明RNA-seq的结果可信度高，而且efeB基因的缺失可能会对菌体鞭毛合成等造成影响。

Fig.2 Accuracy verification of RNA-seq results by RT-qPCR The samples for RT-qPCR was taken at the same culture condition with RNA-seq and-ΔΔCt was used to express the changes of gene transcription level. The tendency of gene up or down-regulation was same with RNA-seq. Values are the mean ± SD of three determinations

将差异表达基因的GO(gene ontology)注释进行了分类统计，结果表明: 在分子功能分类中，差异表达基因主要集中在“核苷酸结合”(GO：00001666)和“结构分子活性”(GO：0005198)；在细胞组成分类中，差异表达基因主要集中在“细胞外膜”(GO：0009279)；在生物过程分类中，差异表达基因主要集中在“三羧酸循环”(GO：0006099)和“纤毛或鞭毛依赖性细胞运动”(GO：0001539)(Fig. 3)。由此推测：大肠杆菌efeB基因的缺失可能影响菌体内的转录翻译、细胞膜的应激响应、三羧酸循环以及鞭毛的合成和运动。

Fig.3 GO distribution map of differentially expressed genes (DEGs) Through GO enrichment analysis, the results of significant correlation between differentially expressed genes and biological functions were obtained. Different colors are used to distinguish different GO classifications. The screening standard for significant enrichment is P<0.05

利用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库的注释信息，对差异表达基因进行途径(pathway)分析，结果表明：大部分差异表达基因富集在“细胞代谢途径”，其次依次在“氧化磷酸化”、“氨基酸代谢”(Fig. 4)，说明大肠杆菌efeB基因的缺失会对菌体的某些生理途径产生调控，从而影响菌体的代谢。

Fig.4 Bubble map of KEGG annotation and classification of differentially expressed genes (DEGs) Qvalue indicates the corrected P value. RichFactor refers to the ratio of the number of genes annotated with the path entry in the differentially expressed genes to the total number of genes located in the path in all annotated genes. The top thirty significantly enriched pathways were plotted, The lowest Qvalue, were selected for statistical analysis. The screening standard for significant enrichment is P<0.05

2.2 efeB基因缺失对菌体生长的影响

根据RNA-seq结果的GO和KEGG分析，efeB的缺失会对大肠杆菌的细胞代谢和胞膜合成产生影响，以及大部分的DyP在酸性条件下有较好的催化活性，本研究比较了出发菌株BL21、突变菌株EcoΔefeB、回补菌株EcoΔefeB/pEE在pH7.0和pH4.5下的生长状况。

结果表明：在pH7.0时，出发菌株BL21，突变菌株EcoΔefeB和回补菌株EcoΔefeB/pEE的生长趋势未见显著差异(Fig. 5A)；而在pH4.5的条件下EcoΔefeB生长明显受到抑制(Fig. 5B)。为了在酸性条件下可以生存，大肠杆菌会诱导多种耐酸系统和相关基因的表达，其中包括有通过改变细胞膜成分和保持膜电荷稳定的保护机制，以及氨基酸依赖型耐酸系统[12]。结合GO分析中，差异表达基因主要集中在“细胞外膜”，以及KEGG富集分析中有“氨基酸代谢”富集，推测在酸性条件下，efeB基因的表达会对大肠杆菌相关耐酸系统和基因产生调控，进而影响到菌体整体的耐酸性。

Fig.5 Growth curves of different strains (A) The growth of the three strains was basically the same at pH 7.0. (B) There was significant difference of cell growth at pH 4.5. The value was expressed as the mean ± SD of three determinations. One-way ANOVA,*P<0.05 and ***P<0.001,compared with efeB mutant

2.3 efeB对环境中铁离子的应答

在大肠杆菌中，EfeB、EfeU和EfeO构成三联体，发挥铁离子内化的作用[10, 13]；新近的研究指出，一些细菌存在鞭毛合成/运动与铁代谢的协同调控[14-16]。本文的GO结果显示，大肠杆菌efeB基因的缺失导致鞭毛合成和运动相关基因的差异表达，这个结果可能也与铁的协同调控有关。为此，本研究在M9培养基的基础上，外源添加FeSO4，考察efeB的表达量的变化，结果正如Fig. 6所示。

Fig.6 The effects of iron ion on transcriptional level of efeB The final concentration of 100 μmol/L FeSO4 was added to M9 medium (M9+Fe). The transcriptional level of efeB was compared with that without FeSO4 by RT-qPCR. The value was expressed as mean ± SD of three experiments, *P<0.05

当外源添加终浓度为100 μmol/L FeSO4时，与没有外源添加相比较，大肠杆菌BL21的efeB基因的表达量显著上调，说明环境中Fe2+浓度的升高促进了大肠杆菌efeB基因的表达，使EfeB参与铁代谢，从而利用铁以供菌体的生长发育所需。

3 讨论

本研究采用RNA-seq的方法，将大肠杆菌efeB突变菌株与出发菌株进行对比，发现差异表达的基因富集到5类生物学功能，其中与鞭毛合成相关的基因变化明显。与单独研究EfeB催化功能相比，转录物组学可从全局基因的转录水平上，了解efeB缺失对大肠杆菌生理和代谢的影响，但是要在1 765个差异表达的基因中，分析出能够显著影响菌体生长发育和新陈代谢的基因，以及EfeB如何调控它们的表达，仍是转录物组学的难点所在。

与之前研究报道的EfeB参与原卟啉原的氧化、ClO2-的降解以及菌体抗氧化损伤不同[17-20]，本研究发现大肠杆菌EfeB具有支持菌体在低pH环境下的生长，影响鞭毛合成相关基因表达的功能，而且这些功能可能与EfeB对环境中铁离子的响应有关。当病原菌感染宿主细胞时，能否有效地获取铁是其生长和存活的限制因素。因此，研究EfeB对铁的响应，以及由此介导的细菌运动与生长，在应对病原菌感染方面将能发挥积极的作用。

综上，本研究虽然发现EfeB参与了大肠杆菌不同基因的表达调控，但尚需对关键基因的调控方式，与铁响应相关的表型和生理变化进行深入的研究。