肺形侧耳菌株的遗传差异分析与农艺性状评价

汪 乔，王祥锋，郭玉峰，王 丽

（山东农业大学植物保护学院/山东省农业微生物重点实验室，山东泰安 271018）

0 引言

肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)又名秀珍菇、环柄侧耳、环柄斗菇等[1]，隶属于真菌门担子菌纲伞菌目侧耳科侧耳属[2]，其口感柔嫩，味道鲜美，又有“味精菇”的美誉[3]。肺形侧耳肉质肥嫩，富含丰富的蛋白质、微量元素、氨基酸和维生素等营养物质[4]，适应性广，且属于中高温型菌类，可弥补高温季节市场空缺，近年来已成为国内发展最快的食用菌品种之一[5]。

栽培规模的日益扩大对适宜不同地区栽培的、满足不同喜好的肺形侧耳品种的需求也逐渐增加，但目前肺形侧耳主栽品种主要是台湾灰色系列，颜色较单一，且有些品种经多年组织扩繁后出现菌种退化和老化现象，制约了该食用菌产业的健康发展，因此研究不同来源的肺形侧耳菌株的遗传多样性及其农艺性状对保护优良种质资源及其高效利用有重要意义[6]。真菌发生拮抗反应是体细胞不亲和的直接表现，可以通过观察菌丝体间拮抗反应（如是否形成色素、菌丝是否隆起等）来判断菌株间的亲缘关系[7]。该方法操作简单、结果直观；但也存在一些问题，如不容易区分遗传背景近似的菌株，而且在观察拮抗线时存在个人主观因素影响，因此采用拮抗反应进行菌株鉴定时需要结合分子标记和农艺性状测定等方法[8]。内部简单重复序列(Internal simple repeat sequence，ISSR)分子标记具有引物设计简单、多态性高和重复性好等优点，目前已广泛应用于食用菌的遗传多样性[9]、杂交育种[10]、品种鉴定[11]及优良杂交子筛选中[12]。任海霞等[13]利用ISSRPCR技术对26个香菇菌株进行DNA指纹分析，并使用NTSYS-PC软件对其遗传差异性进行聚类分析，结果发现相似水平在55%时出现种系分离，相似水平65%时26个菌株聚为5个群组；袁滨等[14]采用拮抗和ISSR分子标记对供试的11个灰树花菌株进行鉴定和遗传多样性分析，发现这2种方法所得到的结果存在一致性，但还存在一定差异；冯伟林等[15]结合ISSR分子标记和农艺性状评价对15个秀珍菇进行遗传多样性分析，在遗传系数为0.87时将菌株分为3个群，同时笔者还发现秀珍菇不同出菇温型与ISSR分子标记分类间存在相关性；陈雪凤等[16]结合拮抗试验、现蕾出菇试验和ISSR分子标记对18个秀珍菇菌株开展多样性研究分析，发现菌株之间存在遗传差异，且出菇温差型、农艺性状都与ISSR分子标记分类相关性较高。由此得出结合拮抗试验、ISSR分子标记和农艺性状评价可以较全面地进行食用菌种质资源的鉴定评价。目前关于肺形侧耳菌株间遗传多样性方面的研究较多，但前人比较分析的肺形侧耳菌株主要为商业栽培菌株，对野生菌株和商业栽培菌株间进行遗传多样性分析的报道较少。基于此，本研究结合拮抗试验、ISSR分子标记技术及农艺性状评价，对10个不同来源的（包括5个野生菌株和5个商业栽培菌株）肺形侧耳菌株的遗传多样性进行综合分析，旨在明确不同来源菌株间的亲缘关系，为优良肺形侧耳菌株选育和今后进行杂交育种时亲本的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试肺形侧耳菌株共10个，其中5个是野外采集菌株，1个（‘秀57’）为商业主栽品种，其余4个为国内各菌种保藏中心赠予，均为产量较高的商业栽培菌株。目前保藏于山东农业大学菌物实验室，具体见表1。

表1 供试肺形侧耳菌株与来源

1.2 培养基配制及培养方法

1.2.1 母种培养基（PDA培养基）马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH自然。

将供试肺形侧耳菌株转接于PDA固体培养基中，每个菌株转接3个培养皿，于25℃条件下培养10天后用于DNA提取。

1.2.2 麦粒原种培养基（质量分数）麦粒98%，石膏粉1%，碳酸钙1%，含水量55%～60%。

将拌匀的麦粒培养料装入菌种瓶中，121℃灭菌1.5 h，完全冷却后接种，置于25℃条件下培养20天左右，菌种长满瓶即可。

1.2.3 栽培种培养基（质量分数）苹果木56%，玉米芯20%，麸皮20%，石灰2%，石膏1%，糖1%，含水量约为60%～62%。

1.3 拮抗对峙试验

在无菌操作环境下，取15个装有PDA培养基的培养皿（直径9 cm），用记号笔在培养皿底上标记边长3 cm正六边形的顶点和中心。将供试菌株长满菌丝体的培养皿用直径0.6 cm打孔器打孔，取相同大小的菌种块按图1所示接种于培养皿相应位置，25℃下培养，观察菌种块菌丝间是否存在拮抗现象[17]。试验设置3个重复，为了便于书写，将菌种PL1～PL10在培养皿上简记为1～10。

图1 供试菌株接种点示意图

1.4 ISSR引物设计与合成

ISSR引物参考哥伦比亚大学公布的序列和Wolfe相关设计[18]，从中挑选出10条合适引物，引物由青岛擎科生物技术有限公司合成，具体序列见表2。

表2 10条ISSR引物序列及退火温度

1.5 遗传差异分析

1.5.1 肺形侧耳菌株DNA的提取 供试菌株基因组DNA参照真菌基因组DNA提取试剂盒（BioTeke，北京）的说明提取。提取的DNA经Nanodrop 2000c定量和琼脂糖凝胶电泳检测纯度后，保存于-20℃备用。

1.5.2 ISSR多态性分析 ISSR-PCR扩增体系为：12.5 μL 2×PCR Master Mix，1 μL 引物，1 μL DNA 模板，用ddH2O补齐到25 μL。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，适宜温度退火（具体见表2）15 s，72℃延伸 40 s，35 个循环；72℃终延伸 7 min，4℃保存。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，对扩增的图谱进行拍照。

1.6 农艺性状测试

采用常规方法搅拌、装袋，用规格12 cm×24 cm×0.05 mm聚乙烯栽培袋装袋，每袋装干料110 g，每个菌株接15袋，接种后置于25℃条件下培养，待菌丝满袋后按常规方法进行出菇管理。试验于2020年6—10月在山东农业大学菌物实训基地进行。

记录不同菌株菌丝生长速度、菌丝颜色、菌丝长势，菌盖大小、颜色，菌柄形态颜色，以采收2潮菇的产量进行统计分析。

1.7 数据处理

将ISSR扩增片段进行统计，有ISSR谱带标记为1，无ISSR谱带标记为0，构建初始数据矩阵，用NTSYS-pc 2.10软件计算菌株间遗传相似系数，并通过非加权配对算数平均法(UPGMA)进行聚类分析，得到聚类图谱。

菌丝长速及产量测定采用SPSS21.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 菌丝拮抗对峙试验结果

在拮抗对峙试验中，来自不同遗传背景的菌株其菌丝的交汇区会形成明显的分界线，发生菌丝隆起以及在平板背面有褐色色素沉淀[19]。亲缘关系较近的菌株菌丝之间无拮抗或拮抗不明显，亲缘关系较为疏远的菌株之间拮抗作用十分明显[20]。本试验中10个供试菌株间的拮抗试验结果如图2和表3所示，从中可以看出，菌株PL3和PL8及PL6和PL9组间菌株拮抗反应不明显，表明2组菌株间亲缘关系较为相近；其余菌株间均能发生明显拮抗反应，从平板背面图可见明显的拮抗线及褐色色素沉淀，表明各菌株间亲缘关系较远。

表3 肺形侧耳菌株间拮抗对峙试验结果

图2 10个菌株间拮抗图谱

2.2 10个肺形侧耳菌株的ISSR多态性分析

利用10条ISSR引物对供试的10个肺形侧耳菌株DNA进行PCR扩增，从中筛选出条带清晰、多态性丰富的ISSR引物。通过引物扩增图谱筛选，得到4条ISSR引物在供试菌株间扩增出75条清晰易辨的多态性片段，大小在100～2500 bp之间，扩增结果如图3所示。结果表明不同肺形侧耳菌株间存在丰富的遗传多样性，且遗传的变异水平较高。

图3 4条引物对肺形侧耳供试菌株扩增的ISSR电泳图谱

2.3 10个肺形侧耳菌株的聚类分析

依据上述4条ISSR引物的多态性数据，利用NTSYS-pc 2.10软件，构建了10个供试菌株的UPGMA聚类分析图。结果（图4）表明，10个供试肺形侧耳菌株遗传相似水平为0.63～0.92。在0.63水平上菌株PL4单独聚为一类，其余9个菌株聚为一类，说明10个菌株中，PL4与其他菌株杂交遗传差异较大。当遗传相似系数为0.69时，供试菌株可以分为3个类群，类群Ⅰ包含4株野生菌株，类群Ⅱ包含5株商业栽培菌株，类群Ⅲ包含1株野生菌株。遗传相似水平最高为0.92，即菌株PL7和PL8，说明两者亲缘关系最为相近。

图4 10个肺形侧耳菌株的聚类分析结果

2.4 10个肺形侧耳菌株菌丝生长情况

供试菌株在PDA培养基上接种7天后的菌丝生长情况如图5和表4所示。从中可以得出，各菌株之间菌丝长势差异较为显著，菌株PL4、PL1、PL5和PL10菌丝生长较快，平均日生长速度分别为0.61、0.61、0.58、0.57 cm/d，菌株PL7、PL8菌丝长速较慢，分别为0.45、0.47 cm/d；菌丝色泽分别为雪白色、白色以及灰白色，PL1和PL4后期会产生色素；除菌株PL7、PL8和PL9外，各菌株菌落边缘都较为整齐；10个供试菌株整体长势较好，菌丝较为浓密，抗杂菌能力较强，无污染情况发生。

图5 10个肺形侧耳菌株接种7天后平板菌丝图

表4 10个肺形侧耳菌株菌丝生长情况

2.5 10个肺形侧耳菌株农艺性状和生物学转化率

对10个肺形侧耳菌株进行出菇试验，并测定主要农艺性状，结果如表5、图6。各供试菌株满袋天数为22～28天，其中野外采集菌株现原基数量较多，菌丝长速普遍较快，菌株PL1和PL4菌丝生长速度最快，平均满袋时间为22天，比菌株PL7和PL8快6天；供试菌株的子实体颜色包括黄白、灰色、白+褐、淡黄、褐色、深灰色6种，野外采集菌株除了PL2外，其他4株子实体颜色均较浅；菌柄形态分为细长、中粗、粗长3类；菌株PL1的产量和生物学转化率最高，前2潮菇平均产量为96.94 g，生物学转化率为88.21%，菌株PL9和PL2次之，菌株PL3产量和生物学转化率最低，产量仅为83.20 g，生物学转化率为75.64%。

图6 10个肺形侧耳菌株出菇照片

表5 10个肺形侧耳菌株农艺性状分析

3 结论与讨论

拮抗反应是体细胞不亲和性的具体表现，作为鉴定菌株遗传差异的传统方法，目前已广泛用于丝状真菌种内菌株的鉴定和分类中[21]。本研究通过拮抗试验发现，10个供试菌株间有43组发生拮抗反应，仅2组未发生拮抗反应，其中野生菌株两两间接触时均出现拮抗线且在平板背面有褐色色素沉淀，说明野生菌株间的亲缘关系较远；试验中还发现菌株PL3与PL8、PL6与PL9并无拮抗线，平板背面也没有色素沉淀，初步推测其可能为体细胞亲和、亲缘关系相近的菌株。

ISSR分子标记可从DNA水平反映菌株间的遗传变异，常用于揭示食用菌遗传多态性和区分种内菌株间亲缘关系[22]。本研究基于ISSR引物扩增出结果，采用UPGMA对肺形侧耳菌株进行聚类分析，结果表明10个供试菌株间遗传相似系数为0.63～0.92，具有一定的遗传多样性与遗传丰富度。当遗传相似系数为0.69时，供试菌株可分为3个类群，类群Ⅰ包含4株野生菌株，类群Ⅱ包含5株商业栽培菌株，类群Ⅲ包含1株野生菌株。本研究筛选获得的ISSR引物可以很好地将野生菌株与商业栽培菌株进行区分，5个商业栽培菌株的亲缘关系较近，推测可能是同类菌株起源相似或基于商业需求选育，导致进化差异小。陆欢等[23]和杨和川等[24]研究金针菇的农户栽培菌株和工厂化栽培菌株的遗传多样性时发现，生产性质相同的菌株亲缘关系较近，推测是由品种选育和生产环境接近所造成，与本研究结果相似。

本研究综合拮抗试验和ISSR分子标记技术2种方法对供试的10个肺形侧耳菌株进行鉴定分析，结果表明2种方法得出的大部分结果较为一致，如野生菌株PL4与其他供试菌株均存在明显拮抗线，ISSR分子标记聚类结果也显示PL4与其他菌株平均相似系数仅为0.63，单独聚为一类；菌株PL6与PL9两者之间不存在拮抗反应，而与其他供试菌株均存在不同程度的拮抗反应，聚类分析结果显示两者相似系数较高，为0.89，表明这2个菌株间的遗传背景相近，亲缘关系较近。本试验中少部分拮抗试验结果和ISSR分子标记分析存在差异，如菌株PL3与PL8拮抗反应不明显，但在聚类分析中两者亲缘关系较远；菌株PL7与PL8间具有明显的拮抗线，但聚类分析时两者单独聚为一支，且菌株间的相似系数高达0.92。在金针菇[23]、灰树花[14]和糙皮侧耳[25]等食用菌的研究中，也发现拮抗结果与亲缘关系分析结果存在差异的情况，推测主要是因为拮抗试验结果易受试验者主观因素、菌种继代次数和培养基等多方面的影响，不能有效区分遗传背景相似或亲缘关系很近的菌株，也进一步表明，拮抗试验在鉴别亲和菌株的遗传关系存在着不确定性，只能作为菌种鉴定的一个辅助方法。

进一步对供试菌株进行出菇试验和农艺性状评价得出，拮抗试验结果与聚类分析结果不一致的2组菌株中，PL3与PL8农艺性状差异较大，菌株PL7与PL8农艺性状差异较小，与聚类分析结果一致。供试菌株间农艺性状均具存在差异，其中野生菌株与商业栽培菌株间差异显著：野生菌株菌丝体生长速度普遍较快，且不经低温刺激就能形成原基，原基数量较多，子实体颜色丰富（黄白、灰色、白+褐、淡黄色），但商品性状较差（菌柄较细、软），且菌株个体间差异较大；商业栽培菌株产量较高，商品性状好，但子实体颜色较为单一，菌株间遗传多样性较差。随着肺形侧耳工厂化栽培的发展和多元化的消费需求，出菇潮次集中、抗逆性强、无需低温刺激且颜色丰富的野生菌株将会是育种的优良亲本材料。

4 结论

本试验结合拮抗试验、ISSR分子标记技术和农艺性状评价等方法，综合分析了10个不同来源的肺形侧耳菌株的遗传多样性，认为供试肺形侧耳菌株间遗传多样性较为丰富，其中商业栽培菌株间亲缘关系较近，野生菌株具有更丰富的遗传多样性。但本研究中并未发现与野生菌株中优良性状（如颜色、出菇温型、出菇潮次集中等）相关的特异分子标记，今后可以进一步加大引物筛选，以获得一些特异的分子标记，为发掘优异的肺形侧耳种质资源和分子标记辅助育种提供依据。