气质联用法测定齐多夫定中甲磺酸甲酯和对甲苯磺酸甲酯

郑杨杨，唐嘉怡，叶明立，车金水，陈梅兰*

（1.浙江树人大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015；2.赛默飞世尔科技（中国）有限公司，上海 201203）

齐多夫定（zidovudine,AZT,1），化学名为1-(3-叠氮-2，3-二脱氧-β-D-呋喃核糖）-5-甲基嘧啶-2，4（1H，3H）-二酮，又名叠氮胸苷，是美国食品及药物管理局（FDA）批准的第一个抗艾滋病(AIDS)药物。尽管该药物有较大的毒副作用，但它与其他药物联合应用可延长艾滋病人的生命和减少垂直传播，在AIDS 药物使用中仍有比较长的市场寿命[1-2]。

齐多夫定的合成路线很多，主要以胸腺嘧啶脱氧核苷(即胸苷)为原料。文献报道典型的路线有两条：（1）以胸苷为原料，与三苯甲基氯反应成醚，保护5 位伯醇羟基，后发生Mitsunobu 反应分子内脱水形成氧化物，在叠氮化钠的作用下生成叠氮化物，最后脱保护得齐多夫定；（2）以胸苷为原料，依次进行成酯、脱水、叠氮化、脱保护氢反应，最后得到齐多夫定。甲磺酸甲酯与对甲苯磺酸甲酯就是在胸苷与羧酸反应时产生的。

甲磺酸甲酯(methyl methane sulfonate,MMS)是一种能够损伤DNA 的烷化剂，主要使嘌呤碱基上的氮、氧原子发生甲基化，导致DNA 双链断裂、点突变[3]。

齐多夫定在生产过程中使用了对甲苯磺酸，反应过程中易生成对甲苯磺酸甲酯，而对甲苯磺酸甲酯的毒性较大。高浓度的对甲苯磺酸甲酯对眼睛、皮肤、粘膜和上呼吸道有强烈刺激作用。还具有强烈的起疱作用，引起手和面部皮疹，多感疼痛、发痒，有时引起手水肿。全身中毒症状一般不发生。对皮肤有致敏作用，可引起荨麻疹。对甲苯磺酸甲酯可燃，具强刺激性，有毒，具致敏性[4]。

由此可见，若齐多夫定中所含甲磺酸甲酯、对甲苯磺酸甲酯的量超出限度，可对人体产生一定危害。因此检测甲磺酸甲酯、对甲苯磺酸甲酯在齐多夫定中的含量有重要意义。目前检测甲磺酸甲酯和对甲苯磺酸甲酯的方法主要有气相色谱法、液相色谱法、气质联用法等，但大多为单独检测，在药物齐多夫定中对甲磺酸甲酯、对甲苯磺酸甲酯同时检测未见报道，不便于实际应用[5-8]。

本文采用气相色谱-质谱法（GC-MS 法）同时检测甲磺酸甲酯、对甲苯磺酸甲酯在齐多夫定药物中的含量，可控制药物生产，提高药物使用安全性。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Agilent 5975-6890N 气质联用仪，四级质量分析器，分流/不分流进样口（美国Agilent 公司）；Agilent DB-5 色谱柱（美国Agilent 公司，30.0 m×250 μm×0.25 μm）；Agilent 不分流衬管（单细径椎，带玻璃毛）。

KQ-300GVDV 型台式三频恒温数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，容量13 L，超声频率45 kHz、80 kHz、100 kHz 可调，超声功率300 W，功率在40%～100%之间可调，进水位在1～140 mm 之间）。

甲磺酸甲酯标准溶液和对甲苯磺酸甲酯标准溶液购自中国医药集团有限公司。齐多夫定样品（样品批号：AT00W110401、AT00W110402、AT00W110403、AT00W110404、AT00W110405）来自台州某药厂，甲醇（色谱纯）、氦气（高纯）。

1.2 色谱与质谱条件

色谱条件：Agilent DB-5 色谱柱（30.0 m×250 μm×0.25 μm），载气（99.999%，He）；进样量1 μL；进样口温度为140 ℃，进样方式为分流（分流比：5:1），载气流速为1 mL/min；柱温：初始温度50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至200 ℃，并保持5 min。

质谱条件：电子轰击离子源（70 eV）；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；辅助通道温度为280 ℃；溶剂延迟3 min；甲磺酸甲酯定性特征离子为65、80、95、109 m/z，定量离子为80 m/z[9-10]；对甲苯磺酸甲酯特征离子为65、91、155、186 m/z，定量离子为91 m/z。

1.3 溶液配制

标准储备液配置：精密称取甲磺酸甲酯10 mg 置于100 mL 容量瓶中，加入色谱纯甲醇溶解并稀释至刻度，配制成100 μg/mL 的储备液。对甲苯磺酸甲酯储备液配制方法同上，配制好的储备液置于4 ℃以下冰箱中保存。使用时，用乙酸乙酯稀释至0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 的溶液。

样品溶液的配制：将0.1 g 齐多夫定样品装入10 mL 容量瓶中，加入甲醇使之溶解，将容量瓶放入超声振荡器振荡30 min，然后用甲醇稀释至刻度，并在进样测定之前用0.22 μm 微孔过滤膜过滤处理。

工作曲线溶液配制：以甲醇为溶剂，甲磺酸甲酯、对甲苯磺酸甲酯为溶质配成溶液。

1.4 样品前处理

精密称取0.1 g 样品 (批号：AT00W110401、AT00W110402、AT00W110403、AT00W110404、AT00W110405)于100 mL 容量瓶中，然后再用去离子水溶解，稀释至刻度。将配制好的齐多夫定溶液20 mL 置于离心管中，再用10 mL 乙酸乙酯提取2 次，于涡旋混合器上混匀2 min，静止，用尖嘴吸管吸出乙酸乙酯层，合并转入洁净的离心管中，氮气缓流下浓缩至0.5 mL，进样1 μL，供测定[11-13]。

精密量取空白溶液、供试品溶液及对照品溶液各1 μL，按程序进样，按外标法计算供试品中甲磺酸甲酯残留的含量。

2 结果与分析

2.1 色谱柱选择

色谱柱是色谱类仪器的“心脏”，选择合适的色谱柱是准确测定目标化合物的保证[14]。为使目标化合物在较短时间内实现良好分离，更准确地测定甲磺酸甲酯和对甲苯磺酸甲酯。对比其他色谱柱，在Agilent DB-5 色谱柱（30.0 m×250 μm×0.25 μm）上甲磺酸甲酯和对甲苯磺酸甲酯的色谱峰比较尖锐对称，背景噪音低，灵敏度高。

2.2 进样口温度选择

根据隔垫和色谱柱的最高使用温度以及相关理化性质，在进样口温度分别为100 ℃、120 ℃、140 ℃、160 ℃、180 ℃下进行测定。结果发现，温度在140 ℃下，两种物质峰面积没有明显变化。因此，140 ℃可以满足这一目标化合物的气化，故将甲磺酸甲酯、对甲苯磺酸甲酯的进样口温度设置为140 ℃。

2.3 柱温条件选择

色谱柱温度是影响分析物分离效果和保留时间的关键因素，柱温的控制方式有恒温和程序升温两种。设置程序升温时，要综合考虑峰的分离效果、峰形及峰分析时间，分析时间短、峰形尖锐对称。实验最终选用的柱温条件：初始温度为50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至200 ℃，并保持5 min。

2.4 方法学考察

分别配制浓度为0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 的甲磺酸甲酯和对甲苯磺酸甲酯两种标准溶液，在最佳色谱条件下进样，并进行线性关系、精密度、检出限和定量限的考察。

精密移取0.1 μg/mL 的甲磺酸甲酯、对甲苯磺酸甲酯溶液各1 μL，分别连续进样6 针测定峰面积，计算RSD，并以10 倍基线噪声（S/N=3）计算得到检出限，标准样品的线性关系、精密度，结果见表1。

表1 回归方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限和重复性

从表1 的测定结果可以看出，该方法的线性关系良好（R2≥0.9993），检出限为0.2～0.4 μg·mL-1，定量限为0.5～0.8 μg·mL-1，相对标准偏差（RSD）≤6.3%。

2.5 样品回收率

称取批号为AT00W110401 样品进行加标试验，结果见表2、表3。从表2、表3 可知，甲磺酸甲酯加标回收率在103.75%～118.72%之间，对甲苯磺酸甲酯加标回收率在101.78%～119.61%之间，表明该方法准确度可靠。

表2 甲磺酸甲酯加标回收率和相对标准偏差

表3 对甲苯磺酸甲酯加标回收率和相对标准偏差

加标色谱图见图1。

图1 齐多夫定样品的加标色谱

2.6 样品测定

根据上述建立的方法对齐多夫定样品（批号：AT00W110401、AT00W110402、AT00W110403、AT00W110404、AT00W110405）经前处理后进样测定，结果未发现5 个批号齐多夫定样品中有甲磺酸甲酯和对甲苯磺酸甲酯。

3 结论

气质联用（GC-MS）法被广泛应用于复杂组分的分离与鉴定，其具有GC 的高分辨率和质谱的高灵敏度，是生物样品中药物与代谢物定性定量的有效工具[15]。由以上检测结果可知，该齐多夫定药品中甲磺酸甲酯和对甲苯磺酸甲酯的残留量未超出标准。样品的线性范围大于0.999，加标回收率在103.75%～119.61%之间，重复性试验的RSD 均小于10%。该方法准确、可靠、灵敏度高,可用于齐多夫定中残留的痕量甲磺酸甲酯和对甲苯磺酸甲酯的检测分析。