乌司他丁缓解子痫前期大鼠高血压、蛋白尿和炎症反应的实验研究

董彦，崔剑，张丽，郎楠，王建波，于志强

子痫前期（pre-eclampsia，PE）是指妊娠20周以后新出现的血压升高或原有的高血压加重，常伴有蛋白尿和其他多器官、多系统症状的疾病［1］。PE的发病率为2%～8%，可引起子痫、肾功能不全、HELLP（hemolysis,elevated liver enzymes,low plateled syndrome）综合征、胎儿生长受限、胎儿窘迫、胎盘早剥及胎死宫内等严重的并发症，是孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一［2］。PE的病因和发病机制尚未完全阐明，其中子宫螺旋动脉滋养细胞重铸障碍，导致胎盘缺血、缺氧并释放多种胎盘因子进入母体血液循环，引起全身炎症反应和血管内皮细胞损伤是PE的重要特征［3］。目前，PE缺乏有效的对因治疗，只能对症治疗以减轻症状，选择适当的时机终止妊娠。因此，针对PE的病因和发病机制，积极寻找治疗或减缓PE的策略，对保证孕产妇和围产儿的安全具有重要意义。

乌司他丁（Ulinastatin，UTI）是从人体尿液中提取的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，可抑制机体释放肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8等炎性介质，缓解机体的炎症反应，改善血管内皮细胞功能，已有效用于重症胰腺炎、脓毒血症及感染性休克等炎性疾病的治疗［4］。但UTI能否抑制PE中的炎症反应，目前尚不清楚。本研究通过建立PE大鼠模型，研究UTI能否通过降低PE大鼠血浆和胎盘中炎性介质水平，减轻血管内皮细胞损伤，从而改善PE大鼠的症状，以期为PE的治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 孕（gestation，G）12 d（G12）SD大鼠购自北京斯贝福生物科技有限公司，SPF级，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0002。共56只，体质量230～270 g，分笼饲养于室温22～24℃、标准清洁、空气流通、昼夜交替循环的环境中，可自由进食、饮水。本研究中所有动物相关操作均遵循国际标准的动物实验管理条例。

1.1.2 主要试剂与仪器 血浆TNF-α、IL-6、血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。兔源TNF-α、vWF、PLGF抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司。兔源IL-6抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。兔源β-Tubulin抗体、所有兔源二抗、磷酸盐缓冲液（PBS）、柠檬酸钠抗原修复液、中性树胶等均购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 动物分组及PE模型的建立 随机数字表法将56只大鼠随机分为对照（C）组、PE组、PE+U1组、PE+U2组，每组14只。PE组大鼠分别于G13～G19腹腔注射左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME，上海博湖生物科技有限公司）200 mg·kg-1·d-1，建立PE模型,C组注射等量生理盐水。PE+U1组和PE+U2组大鼠于G13～G19腹腔注射L-NAME 200 mg·kg-1·d-1，同时分别腹腔注射UTI 5 000和10 000 IU·kg-1·d-1，C组、PE组注射等量生理盐水。

1.2.2 孕鼠血压和24 h尿蛋白测定 4组大鼠均于G12、G13、G15、G17、G19采用大鼠尾套无创血压仪测量尾动脉收缩压（SBP）。测量前先把孕鼠置于预热箱内预热至38～40℃，待其安静后测量。每只大鼠测量3次，取平均值。分别于G12和G19用标准代谢笼收集24 h尿液，以考马斯亮蓝染色（上海瑞番生物科技有限公司）测定24 h尿蛋白水平。

1.2.3 取材 所有大鼠于G20时在七氟醚麻醉下行剖宫产术，获取胎盘组织，同时于腹主动脉采集血液标本。

1.2.4 血浆中TNF-α、IL-6、vWF、PLGF水平测定 取血标本6 mL置入含EDTA抗凝剂的试管中，充分混匀后3 000 r/min离心20 min，取上清液，采用ELISA法测定血浆中TNF-α、IL-6、vWF、PLGF水平。所有大鼠中，C、PE+U1和PE+U2组中均有7例，PE组中有6例血标本量达到6 mL，其余大鼠血标本量未达到实验要求。

1.2.5 Western blot检测胎盘中TNF-α、PLGF、IL-6、vWF蛋白表达 将胎盘组织放入EP管内，加入RIPA裂解液，组织剪碎后以超声处理。超声处理后的组织液置于4℃冰箱中静置30 min，4℃、16 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法蛋白定量。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）后进行转膜，加入TNF-α、PLGF、IL-6、vWF一抗（均为1∶1 000稀释）。4℃孵育过夜，漂洗后加入二抗（1∶5 000稀释）室温孵育1 h，将化学发光试剂A液与B液等量混合，孵育PVDF膜1 min，于凝胶成像仪中成像。使用Image J软件进行灰度分析。通过计算目的条带与内参蛋白β-Tubulin的比值，计算目的蛋白TNF-α、PLGF、IL-6、vWF的相对表达量，分析各实验组目的蛋白的表达变化。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 9软件进行数据分析，正态分布资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组间的多重比较采用Bonferroni检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UTI对PE大鼠血压和24 h尿蛋白的影响 56只孕鼠中有4只注射L-NAME后出现流产，其中PE组2只，PE+U1和PE+U2组各1只。G12时，各组大鼠SBP和尿蛋白水平差异均无统计学意义（P＞0.05）；G13～G19时，PE、PE+U1和PE+U2组SBP均较C组升高，PE+U1和PE+U2组SBP较PE组降低，G19时PE+U2组降低SBP的作用更明显（P＜0.05）。G19时，PE、PE+U1和PE+U2组尿蛋白水平均较C组升高，PE+U1和PE+U2组尿蛋白水平较PE组降低，PE+U2组降低尿蛋白的作用更明显（P＜0.05）。见表1、2。

Tab.1 Comparison of SBP of rats during different gestation between the four groups表1 各组大鼠不同孕期SBP水平比较（mmHg，±s）

Tab.1 Comparison of SBP of rats during different gestation between the four groups表1 各组大鼠不同孕期SBP水平比较（mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；1 mmHg=0.133 kPa；a与C组比较，b与PE组比较，c与PE+U1组比较，P＜0.05。

组别C组PE组PE+U1组PE+U2组F n 14 12 13 13 G12 112.86±5.87 111.75±5.97 110.15±7.14 113.39±5.32 0.716 G13 110.14±6.06 133.53±6.61a 123.92±7.19ab 118.23±8.88ab 23.670＊＊组别C组PE组PE+U1组PE+U2组F G15 110.79±5.83 147.00±5.78a 128.23±8.06ab 122.02±6.04ab 69.610＊＊G17 111.29±4.84 142.58±6.67a 126.69±7.78ab 120.00±7.70ab 47.980＊＊G19 116.50±6.50 144.67±4.36a 129.92±7.15ab 123.31±5.62abc 50.460＊＊

Tab.2 Comparison of 24-hour urinary protein levels of rats on G12 and G19 between the four groups表2 各组大鼠G12和G20 24 h尿蛋白水平的比较（mg，±s）

Tab.2 Comparison of 24-hour urinary protein levels of rats on G12 and G19 between the four groups表2 各组大鼠G12和G20 24 h尿蛋白水平的比较（mg，±s）

＊＊P＜0.01；a与C组比较，b与PE组比较，c与PE+U1组比较，P＜0.05。

组别C组PE组PE+U1组PE+U2组F n 14 12 13 13 G12 91.07±12.60 84.25±9.95 91.23±10.37 84.46±10.34 1.673 G19 89.71±11.65 140.42±14.36a 128.08±8.56ab 100.85±11.16abc 51.350＊＊

2.2 UTI对PE大鼠炎症指标的影响 G20时，与C组相比，PE组、PE+U1组血浆和胎盘中TNF-α、IL-6水平升高，PE+U2组仅胎盘中TNF-α水平升高（P＜0.05）；与PE组相比，PE+U1、PE+U2组血浆和胎盘中TNF-α、IL-6水平均降低（P＜0.05）；与PE+U1组相比，PE+U2组血浆和胎盘中TNF-α水平、胎盘中IL-6水平降低（P＜0.05），但血浆中IL-6水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表3，图1。

2.3 UTI对血管内皮损伤指标的影响 G20时，与C组相比，PE组、PE+U1组血浆和胎盘中PLGF水平降低、vWF水平升高，PE+U2组仅血浆和胎盘中vWF水平升高（P＜0.05）；与PE组相比，PE+U1、PE+U2组血浆和胎盘中PLGF水平升高，vWF水平降低（P＜0.05）；与PE+U1组相比，PE+U2组血浆和胎盘中vWF水平降低（P＜0.05），但血浆和胎盘中PLGF水平差异无统计学意义（P＞0.05）；见表4，图1。

Tab.3 Comparison of inflammatory cytokines levels in plasma and placenta between the four groups表3 各组大鼠血浆和胎盘中炎性因子水平的比较（±s）

Tab.3 Comparison of inflammatory cytokines levels in plasma and placenta between the four groups表3 各组大鼠血浆和胎盘中炎性因子水平的比较（±s）

＊＊P＜0.01；a与C组比较，b与PE组比较，c与PE+U1组比较，P＜0.05。

组别C组PE组PE+U1组PE+U2组F n7 6 7 7血浆TNF-α（ng/L）21.64±6.43 69.94±12.92a 49.55±10.59ab 34.05±6.02bc 32.660＊＊IL-6（ng/L）16.80±4.94 41.37±7.83a 27.01±4.62ab 19.97±2.97b 25.790＊＊n 14 12 13 13胎盘TNF-α 0.31±0.14 1.06±0.09a 0.87±0.11ab 0.71±0.12abc 95.860＊＊IL-6 0.40±0.09 0.97±0.21a 0.68±0.18ab 0.51±0.11bc 34.580＊＊

Fig.1 Expressions of TNF-α,IL-6,vWF and PLGF proteins in placental tissue in the four groups图1 4组大鼠胎盘组织中TNF-α、IL-6、vWF、PLGF的蛋白表达

Tab.4 Comparison of vascular endothelial injury marker levels in plasma and placenta between the four groups表4 各组大鼠血浆和胎盘中血管内皮损伤指标比较（±s）

Tab.4 Comparison of vascular endothelial injury marker levels in plasma and placenta between the four groups表4 各组大鼠血浆和胎盘中血管内皮损伤指标比较（±s）

＊＊P＜0.01；a与C组比较，b与PE组比较，c与PE+U1组比较，P＜0.05。

组别C组PE组PE+U1组PE+U2组F n7 6 7 7血浆vWF（μg/L）0.66±0.29 1.81±0.57a 1.19±0.18ab 0.98±0.10abc 13.440＊＊PLGF（ng/L）184.54±38.00 94.48±34.75a 144.99±11.43ab 160.96±13.28b 12.660＊＊n 14 12 13 13胎盘vWF 0.24±0.07 0.61±0.10a 0.47±0.11ab 0.36±0.09abc 36.660＊＊PLGF 0.56±0.10 0.24±0.13a 0.39±0.07ab 0.48±0.07b 26.420＊＊

3 讨论

3.1 PE的发病与全身和胎盘的炎症反应有关 PE是妊娠期特有的疾病，其发病机制与全身和胎盘的炎症反应及胎盘血管的形成异常有关。全球每年约有76 000例产妇和500 000例胎儿及新生儿死于PE相关疾病［5］。研究表明，与正常妊娠或非孕期的育龄女性相比，PE患者体内炎性因子水平增加，有血管内皮功能障碍［6］。PE患者血浆中TNF-α和IL-6水平明显高于正常妊娠女性，且两者的血浆水平被认为是评价PE患者预后的指标之一［7］。因此，TNFα和IL-6在PE的发生、发展过程中发挥了重要作用。

炎症存在时TNF-α主要由巨噬细胞和单核细胞产生，并进一步增加IL-6等其他细胞因子和趋化因子的生成［8］。体内和胎盘中TNF-α、IL-6等炎性因子增加后，引起氧化应激反应，降低一氧化氮生物利用度，导致细小血管收缩和PE的发生；过多的TNF-α增加血管通透性，特异性地抑制滋养层细胞迁移和整合到内皮细胞中，促进淋巴细胞活化和成纤维细胞增殖，进一步引起血管痉挛，影响胎盘血供［9］。因此，抑制炎性介质的产生可能有益于PE的治疗。

3.2 UTI抑制血浆及胎盘中的炎症反应 UTI是一种广谱的丝氨酸蛋白酶抑制剂，存在于尿液、血浆以及所有主要器官。UTI可明显抑制感染性动物模型中TNF-α和IL-6的分泌，抑制蛋白水解酶活性和炎性细胞因子的释放，清除氧自由基，稳定溶酶体膜［10］。临床研究发现，UTI可通过下调TNF-α和IL-6的表达，缓解脓毒症导致的急性肺损伤［11］。体外研究发现，在人脐静脉血管内皮细胞中加入TNF-α或重度PE患者血清后，血管内皮细胞凋亡数量增多，体外培养体系中加入UTI可降低血管内皮细胞凋亡率，表明UTI可阻断炎性因子对PE血管内皮细胞的损伤［12］。

本研究发现，UTI可缓解PE大鼠的高血压、降低尿蛋白水平、改善大鼠受损的肾功能，并降低血浆及胎盘vWF水平。其原因可能为：UTI降低PE大鼠血浆及胎盘中炎性介质（TNF-α、IL-6）水平，抑制胎盘的炎症反应；降低炎性介质引起的血管内皮细胞高通透性，保护血管内皮的完整性，缓解血管痉挛和全身炎症性血管内皮水肿。UTI缓解PE的可能机制：UTI通过抑制蛋白水解酶、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）活性，减少巨噬细胞释放TNF-α、IL-6等炎性介质；通过抑制核转录因子活性减少TNF-α和IL-6等炎性介质生成；通过RhoA/ROCK信号通路减轻TNF-α引起的血管内皮细胞损伤［13］。

3.3 UTI减轻PE胎盘血管内皮的损伤 PLGF是血管内皮生长因子家族的成员之一，在血管生成中有促进胎盘血管发育和成熟的作用［14］。重度PE患者血清和胎盘中的PLGF水平明显低于轻度PE患者和血压正常的女性；妊娠晚期母体PLGF水平较低时，妊娠期高血压、围产期不良结局以及胎儿生长受限的发生率均增加［15］。vWF是由内皮细胞合成并分泌的一种具有黏附功能的糖蛋白，在正常孕妇体内轻度升高，在重度PE患者体内明显升高。当血管内皮细胞受损时，vWF释放到血液中，故血浆vWF水平升高可作为反映血管内皮细胞受损的指标［16］。本研究发现UTI能降低PE大鼠血浆及胎盘vWF水平、提升PLGF水平，故推测UTI可减轻血管内皮的损伤，改善胎盘血管的发育和胎盘的供血，其机制可能与UTI抑制血浆和胎盘中的炎症反应有关。同时，本研究发现，10 000 IU·kg-1·d-1UTI在降低血浆和胎盘中炎性介质水平、抑制vWF释放、缓解蛋白尿等作用方面优于5 000 IU·kg-1·d-1。然而，在缓解高血压时2种剂量差别微弱，仅在孕晚期（G19）时有差异。

3.4 UTI用于PE的应用前景 国内外关于UTI用于产科患者的研究较少，阴道内注射UTI可预防宫颈缩短合并下生殖道炎症引发的早产［17］。不伴有妊娠期高血压的产妇，围术期预防性静脉滴注UTI 5 000 IU·kg-1·d-1可改善剖宫产术中的高凝血状态，有助于预防术后深静脉血栓形成［18］。本课题组既往研究发现，UTI可降低重度PE剖宫产术患者血浆vWF水平，推测UTI可减轻患者血管内皮损伤，有利于PE的治疗［19］。然而，该研究仅限于胎儿娩出后（断脐后）单次用药，缺乏妊娠期间重复用药的观察，无法系统性地研究UTI的作用机制及评价治疗效果。人类PE的发病机制是复杂的、多因素的，不同于注射L-NAME建立的PE大鼠模型。因此，UTI能否安全有效地用于预防和治疗人类PE，仍需进一步审慎地研究。