LncRNA MIAT靶向调节miR-128-3p对心房颤动大鼠心室重构和心肌纤维化的影响

邢佳侬，梁卓，邢爱君，刘俊兰，彭宏超，张天桦，张春来

心房颤动（atrial fibrillation，AF）为常见心律失常症状，易引发心力衰竭、肾功能损伤、动脉栓塞等并发症，严重威胁患者生命健康［1-2］。心肌纤维化导致的心室重构是AF的主要病理特征，多种炎性因子诱导并放大的炎症反应与其关系密切，抑制炎症反应可降低AF发生风险，减轻心肌纤维化与心室重构［3-4］。心肌梗死相关转录本（myocardial infarction associate transcript，MIAT）是一种保守的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA），在心肌梗死、AF等心血管疾病的发病及进展过程中起到关键调控作用；降低MIAT的表达可显著减轻炎症反应，延缓心肌纤维化、心肌肥厚等病理改变，改善心力衰竭症状［5-6］。研究显示，LncRNA MIAT在AF大鼠中表达显著增加，下调MIAT能显著缓解AF，减轻其诱导的心肌细胞凋亡和心肌纤维化［7］。miR-128-3p是MIAT的一个下游调控因子，其表达水平与MIAT呈负相关［8］。miR-128-3p作为一种重要的炎症调控因子，与AF的发生、发展过程关系密切。过表达miR-128-3p可明显抑制脂多糖诱导的炎症反应［9］，还可降低转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）水平，进而抑制AF小鼠心房心肌组织纤维化进程［10］。由此可知，miR-128-3p是治疗AF的一个重要作用靶点。目前，LncRNA MIAT可否通过靶向调节miR-128-3p表达，从而影响AF大鼠心室重构和心肌纤维化尚鲜见报道。本研究通过建立AF大鼠模型，探究LncRNA MIAT靶向调节miR-128-3p对AF大鼠心室重构和心肌纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 SD雄性大鼠75只购自郑州市惠济区华兴实验动物养殖场［SCXK（豫）2019－0002］，无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级，6～7周龄，体质量200～230 g。无水氯化钙（货号C7250）、乙酰胆碱（货号G8320）、天狼星红染色试剂盒（货号G3632）购自北京索莱宝科技有限公司；白细胞介素（interleukin，IL）-6测试盒（H007）、IL-18测试盒（H015）、TGF-β1测试盒（H034-2）购自南京建成生物工程研究所有限公司；RNA提取液（货号G3013）购自Servicebio公司；LncRNA MIAT siRNA质粒、miR-128-3p siRNA质粒、空载质粒、miR-128-3p与U6引物、野生型miR-128-3p 3′-UTR报告质粒、突变型miR-128-3p 3′-UTR报告质粒、miR-128-3p 3′-UTR无义序列、LncRNA MIAT过表达质粒、LncRNA MIAT空载质粒购自上海吉玛制药技术有限公司；人心肌细胞（货号CP-H076）、人心肌细胞完全培养基（货号CM-H076）、含酚红的0.25%胰蛋白酶溶液（货号PB180224）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；LipofectamineTM2000（货号11668019）、Opti-MEM培养基（货号31985-070）购自美国Invitrogen公司；一步法反转录荧光定量试剂盒（货号B639277-0100）、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号E608001）购自上海生工生物工程股份有限公司；Langendorff离体心脏灌流系统（型号Myoheart）购自北京拜安吉科技有限公司；电子分析天平（型号FA1004）购自上海津平科学仪器有限公司；多功能酶标仪（型号Varioskan LUX）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；光学显微镜（型号Axiovert 200）购自德国ZEISS公司；冰冻切片机（型号CM1950）购自德国Leica公司；实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）系统（型号qPCR 96K）购自澳大利亚KEWLAB Pty Ltd公司等。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠模型制备及分组 将无水氯化钙、乙酰胆碱加入生理盐水中溶解混匀，得到含有10 g/L氯化钙和33.66 mg/L乙酰胆碱的AF诱导液500 mL。取SD大鼠63只，以1 mL/kg舌下静脉注射AF诱导液，隔日给药1次，共给药14次［11］。给药结束后行心电图检测，造模成功大鼠共60只，以随机数字表法分为模型组、LncRNA MIAT siRNA质粒（MIAT）组、miR-128-3p siRNA质粒（miR-128-3p）组、LncRNA MIAT siRNA质粒+miR-128-3p siRNA质粒（MIAT+miR-128-3p）组、空载质粒组，每组12只。另取12只正常SD大鼠，舌下静脉注射等剂量生理盐水，作为对照组。参照文献［10］及说明书：MIAT组尾静脉注射LncRNA MIAT siRNA质粒，miR-128-3p组尾静脉注射miR-128-3p siRNA质粒，MIAT+miR-128-3p组尾静脉注射LncRNA MIAT siRNA质粒和miR-128-3p siRNA质粒，空载质粒组尾静脉注射LncRNA MIAT siRNA和miR-128-3p siRNA相对应的空载质粒，模型组和对照组大鼠尾静脉注射与MIAT+miR-128-3p组相同剂量的生理盐水，各组大鼠均每周给药2次，共用药2周。

1.2.2 大鼠心房肌电生理及左心室质量指数检测 以乙醚气体麻醉各组所有大鼠，测量体质量后断头处死，然后开胸采集心脏血液，4℃1 000×g离心15 min，取上清液，-80℃保存备用；取出上述各组大鼠心脏置于Langendorff离体心脏灌流系统中，等其自主节律稳定时，以氯化银电极检测左心房有效不应期（effective refractive period，ERP）和90%动作电位时程（90%action potential duration，APD90）；将心房肌电生理水平检测结束后的心脏左心室剪下，称质量，计算左心室质量指数=左心室质量/体质量（mg/g）；剪下左心室心肌组织0.5 g，分组标记并保存在液氮备用；剩余心肌组织经包埋、冰冻成块后切5μm片备用。

1.2.3 天狼星红染色检测大鼠心肌组织纤维化程度 取1.2.2中各组心肌病理切片，室温放置5 min、冰丙酮固定、30%蔗糖脱水后，加入天狼星红染液，染色完成后封片，每张切片于200倍放大倍数下随机读取5个视野拍照，采用Image J分析并计算心肌胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）=胶原面积/所测视野总面积×100%。

1.2.4 酶联免疫吸附试验测定大鼠血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平 取1.2.2中的血清冻融后，参照试剂盒说明书测量IL-18、IL-6、TGF-β1水平。

1.2.5 qPCR检测大鼠心肌组织miR-128-3p表达水平 提取1.2.2中心肌组织总RNA后，以反转录荧光定量PCR扩增实验检测miR-128-3p表达水平。反应体系（20μL）：一步法qPCR主混合液10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL、酶混合物0.65μL、RNA模板0.55μL、无RNA酶去离子水8μL。反应条件：50℃反转录5 min，95℃预变性3 min；95℃10 s，60℃30 s，40个循环。选用U6做内参，基因引物序列，见表1。

Tab.1 qPCR primer sequence表1 qPCR引物序列

1.2.6 LncRNA MIAT对miR-128-3p的靶向调控作用 TargetScan Release 7.2生物信息学研究显示，LncRNA MIAT和miR-128-3p之间有结合位点。人心肌细胞快速冻融复苏后300×g离心5 min，以专用的人心肌细胞完全培养基重悬细胞沉淀，混匀后置于37.5℃、5%CO2细胞培养箱中无菌培养。细胞融合度达到80%时进行传代，接种在24孔培养板中，分为miR-128-3p无义+空载组（将miR-128-3p 3′-UTR无义序列+LncRNA MIAT空载质粒转染至人心肌细胞）、miR-128-3p无义+过表达组（将miR-128-3p 3′-UTR无义序列+LncRNA MIAT过表达质粒转染至人心肌细胞）、miR-128-3p野生+空载组（将野生型miR-128-3p 3′-UTR报告质粒+LncRNA MIAT空载质粒转染至人心肌细胞）、miR-128-3p野生+过表达组（将野生型miR-128-3p 3′-UTR报告质粒+LncRNA MIAT过表达质粒转染至人心肌细胞）、miR-128-3p突变+空载组（将突变型miR-128-3p 3′-UTR报告质粒+LncRNA MIAT空载质粒转染至人心肌细胞）和miR-128-3p突变+过表达组（将突变型miR-128-3p 3′-UTR报告质粒+LncRNA MIAT过表达质粒转染至人心肌细胞），各组均遵照LipofectamineTM2000试剂说明书进行转染，测定各组细胞双荧光素酶活性［7］。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0.1软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据以±s表示，多组间比较行单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌纤维化程度、心房肌电生理水平指标及CVF比较 对照组的心肌组织几乎无纤维化，模型组的心肌组织产生纤维化变性。相比模型组，MIAT组大鼠的心肌组织纤维化减轻，miR-128-3p组大鼠的心肌组织纤维化加重，MIAT+miR-128-3p组大鼠的心肌组织纤维化无明显变化。与对照组比较，模型组ERP、APD90降低，左心室质量指数、心肌CVF升高（P＜0.05）。与模型组比较，MIAT组ERP、APD90升高，而左心室质量指数、心肌CVF降低（P＜0.05），miR-128-3p组ERP、APD90降低，而左心室质量指数、心肌CVF升高（P＜0.05），空载质粒组ERP、APD90、左心室质量指数、心肌CVF差异无统计学意义（P＞0.05）。与MIAT组比较，MIAT+miR-128-3p组ERP、APD90降低，而左心室质量指数、心肌CVF升高（P＜0.05）。与miR-128-3p组比较，MIAT+miR-128-3p组ERP、APD90升高，而左心室质量指数、心肌CVF降低（P＜0.05）。见表2，图1。

Tab.2 Comparison of atrial electrophysiological indexes,left ventricular mass index and myocardial CVF between the six groups of rats表2 各组大鼠心房肌电生理水平指标、左心室质量指数、心肌CVF比较 （n=12，±s）

Tab.2 Comparison of atrial electrophysiological indexes,left ventricular mass index and myocardial CVF between the six groups of rats表2 各组大鼠心房肌电生理水平指标、左心室质量指数、心肌CVF比较 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与MIAT组比较，d与miR-128-3p组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组MIAT组miR-128-3p组MIAT+miR-128-3p组空载质粒组F ERP（ms）46.01±3.02 20.15±2.58a 43.57±3.64b 12.63±0.82b 22.08±2.16cd APD90（ms）65.13±4.81 48.94±3.97a 62.87±4.56b 37.58±2.01b 51.89±2.68cd左心室质量指数（mg/g）12.20±2.01 21.05±3.48a 13.97±2.46b 29.03±2.85b 20.01±2.62cd心肌CVF（%）0.52±0.17 20.53±2.04a 3.74±1.23b 31.67±3.52b 18.91±2.19cd 19.78±2.27 351.599＊＊49.72±4.05 84.145＊＊21.67±2.34 61.401＊＊21.06±2.23 356.630＊＊

2.2 各组大鼠血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平比较 与对照组比较，模型组血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，MIAT组血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平降低（P＜0.05），miR-128-3p组血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平升高（P＜0.05），空载质粒组血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与miR-128-3p组比较，MIAT+miR-128-3p组血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平降低（P＜0.05）。与MIAT组比较，MIAT+miR-128-3p组血清IL-18、IL-6、TGF-β1水平升高（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-18,IL-6,TGFβ1 and expression of miR-128-3p in myocardial tissue between the six groups of rats表3 各组血清IL-18、IL-6、TGF-β1及心肌组织miR-128-3p水平比较 （n=12，±s）

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-18,IL-6,TGFβ1 and expression of miR-128-3p in myocardial tissue between the six groups of rats表3 各组血清IL-18、IL-6、TGF-β1及心肌组织miR-128-3p水平比较 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与MIAT组比较，d与miR-128-3p组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组MIAT组miR-128-3p组MIAT+miR-128-3p组空载质粒组F IL-18（μg/L）0.39±0.04 1.42±0.13a 0.43±0.09b 2.38±0.22b 1.39±0.18cd IL-6（μg/L）1.32±0.24 14.29±2.65a 1.97±0.43b 25.32±3.17b 13.14±3.01cd TGF-β1（ng/L）120.68±26.83 638.15±65.38a 125.49±28.16b 931.27±86.67b 629.82±70.54cd miR-128-3p 1.01±0.24 0.56±0.07a 0.96±0.19b 0.31±0.05b 0.59±0.08cd 1.44±0.26 228.185＊＊14.75±2.82 170.296＊＊635.91±72.08 321.152＊＊0.55±0.06 46.911＊＊

Fig.1 The degree of myocardial fibrosis detected by Sirius red staining(×200)图1 天狼星红染色检测大鼠心肌纤维化程度（×200）

2.3 各组大鼠心肌组织miR-128-3p表达比较 与对照组比较，模型组心肌组织miR-128-3p表达水平降低（P＜0.05）。与模型组比较，MIAT组心肌组织miR-128-3p表达水平升高（P＜0.05），miR-128-3p组miR-128-3p表达水平降低（P＜0.05），空载质粒组miR-128-3p表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与miR-128-3p组比较，MIAT+miR-128-3p组心肌组织miR-128-3p表达水平升高（P＜0.05）。与MIAT组比较，MIAT+miR-128-3p组心肌组织miR-128-3p表达水平降低（P＜0.05），见表3。

2.4 MIAT对miR-128-3p的靶向调节 TargetScan Release 7.2生物信息学研究显示，LncRNA MIAT和miR-128-3p之间有结合位点，见图2。与miR-128-3p野生+空载组比较，miR-128-3p野生+过表达组相对荧光素酶活性降低（P＜0.05）；miR-128-3p突变+空载组和miR-128-3p突变+过表达组、miR-128-3p无义+空载组和miR-128-3p无义+过表达组间相对荧光素酶活性差异均无统计学意义（P＞0.05），见图3。

Fig.2 Bioinformatics of TargetScan Release7.2 predicts the binding site between lncRNA MIAT and miR-128-3p图2 TargetScan Release7.2的生物信息学预测LncRNA MIAT和miR-128-3p之间的结合位点

Fig.3 Relative luciferase activity of cells in each group图3 各组细胞相对荧光素酶活性值

3 讨论

AF可导致心房收缩、舒张功能减退，使心脏泵血功能明显受损甚至丧失，患者会因心力衰竭而死亡。临床主要通过导管消融术对AF进行治疗，但费用高昂，且复发率高，因此积极探究AF发生、发展机制，寻找更有效的治疗手段具有重要临床价值［12-13］。本研究采用舌下静脉注射氯化钙-乙酰胆碱混合液的方法诱导AF大鼠模型，结果显示，与对照组比较，模型组大鼠的ERP、APD90降低，左心室质量指数、心肌CVF升高，表明大鼠出现心室重构和AF症状，AF模型构建成功。研究显示，多种炎症标志物在AF过程中升高，其引发的炎症级联反应是导致心肌纤维化改变，进而造成心室重构的重要因素，采用免疫调节剂进行抗炎是治疗AF的有效方法［14-15］。MIAT为一种调控炎症的长链非编码RNA，参与介导心力衰竭、AF等疾病的发病机制，可促进心力衰竭患者炎症因子和心肌胶原合成，而沉默LncRNA MIAT可抑制炎症，减轻心肌纤维化导致的心力衰竭［16］，缓解心房重构，改善AF症状［17］。本研究结果显示，相比模型组，MIAT组大鼠中LncRNA MIAT表达及IL-18、IL-6、TGF-β1水平降低，左心室质量指数和CVF也降低，大鼠心肌电生理指标ERP、APD90水平升高，表明敲低MIAT表达可抑制炎症，减少胶原合成，减轻心肌纤维化变性，进而改善心肌电生理功能，延缓心室重构进程，减轻大鼠AF症状，证实了LncRNA MIAT参与调控AF发生、发展过程，提示MIAT是AF的重要治疗靶点。

研究显示，miR-128-3p可调控氧化应激和炎症的发生、发展，进而介导心肌梗死与AF等心肌损伤性疾病的发病过程，促进miR-128-3p表达可显著降低致炎因子合成水平，减轻脂多糖诱导的心肌炎症损伤［18］。过表达miR-128-3p可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的人心肌纤维化变性［10］。在心肌梗死小鼠中miR-128-3p下调，上调其表达可使小鼠心肌细胞免于凋亡［19］。另有研究显示，MIAT可负向调控miR-128-3p的表达［20］。但miR-128-3p是否为MIAT介导AF发生及病情进展的下游分子靶点并不清楚。本研究结果显示，相比模型组，miR-128-3p组中大鼠血清炎性因子IL-18、IL-6及致纤维化因子TGFβ1水平升高，且左心室质量指数和CVF升高，大鼠心肌电生理指标ERP、APD90水平降低，表明下调miR-128-3p表达可促进炎症进展，加重大鼠心室重塑和心肌纤维化；而敲低MIAT表达可提高心肌组织miR-128-3p表达，提示miR-128-3p参与介导敲低MIAT表达对AF的治疗过程。另外，相比MIAT组，MIAT+miR-128-3p组大鼠ERP、APD90、心肌组织miR-128-3p表达均降低，左心室质量指数、CVF、血清IL-18、IL-6及TGF-β1水平均升高，表明miR-128-3p siRNA质粒与LncRNA MIAT siRNA质粒合用时，miR-128-3p siRNA质粒可减弱MIAT敲低对炎性因子表达的抑制作用，拮抗MIAT敲低对AF大鼠心室重塑和心肌纤维化的缓解作用，最终逆转MIAT敲低对AF大鼠AF症状的改善作用。另外，双荧光素酶报告基因试验结果显示，LncRNA MIAT对miR-128-3p具有靶向调节作用，表明敲低MIAT表达可通过提高心肌组织miR-128-3p表达而起到抑制炎症作用，进而减轻AF大鼠心室重塑和心肌纤维化，改善心功能，揭示LncRNA MIAT可通过靶向调节miR-128-3p表达，介导AF引发的心室重构和心肌纤维化过程。

综上所述，LncRNA MIAT参与介导AF的发生、发展，敲低MIAT可上调miR-128-3p，减少炎性细胞因子与致纤维化因子合成，抑制心肌炎症及纤维化，延缓心室重构进程，最终改善AF症状，而靶向调控miR-128-3p表达是其发挥上述作用的分子机制之一。