动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者外周血单个核细胞中瞬时受体电位通道M2 水平与介入治疗预后的关系

吉思璇， 吴 迪， 白曼莫

动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH） 是颅内动脉瘤破裂引发的一种脑出血性疾病，致残率和致死率均较高［1-2］。 据报道，aSAH 患者接受及时治疗后1 年内病死率高达50%，远期病死率仍高达10%～24%［3-5］。 探究可评估aSAH 预后的指标有着重要意义， 可辅助临床治疗方案的制定。 瞬时受体电位通道M2（transient receptor potential melastatin 2，TRPM2） 是瞬时受体电位蛋白超家族中一员，作为一种重要的离子通道介导多种细胞反应，如通过其钙离子可调节过氧化氢诱导的细胞死亡，还会促进单核细胞和巨噬细胞分泌趋化因子，加剧炎症反应［6］。Pan 等［7］研究表明，干扰TRPM2 表达可降低氧化应激损伤、 细胞内钙离子浓度及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白（NLRP）3 炎性小体激活，从而抑制葡萄糖剥夺诱导的神经元细胞凋亡。 基于上述研究， 有理由认为TRPM2 参与了aSAH 进展过程，是其预后评估的潜在生物标志物。 目前鲜有研究分析TRPM2 与aSAH预后的关系， 本研究选取接受介入治疗的aSAH 患者作为研究对象， 分析TRPM2 与aSAH 预后的关系，以期为aSAH 预后评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2019 年8 月至2021 年5 月在三亚市中医院参照《中国蛛网膜下腔出血诊治指南2019》［8］、经血管造影确诊并接受介入治疗的aSAH 患者作为研究对象。纳入标准：①首次发病，且在发病12 h 内接受支架联合弹簧圈动脉瘤栓塞术治疗； ②年龄≤70 岁；③随访资料完整；④签署手术知情同意书。 排除标准：①非动脉瘤破裂诱发的脑出血；②有冠心病史、脑卒中史、神经退行性疾病史、下肢动脉硬化闭塞症史或恶性肿瘤史等；③心肝肾功能异常；④生命体征不稳定； ⑤国际标准化比值＞1.4 或血小板计数＜100×109/L。 本研究符合《赫尔辛基宣言》，已获医学伦理委员会批准（2021-006）。

1.2 介入治疗

手术在全身麻醉下进行，采用Seldinger 技术穿刺股动脉，置入6 F 导管，全身肝素化， DSA 造影测量动脉瘤大小，选择适宜支架；将支架导管置入距动脉瘤远端1 cm 处，Echolon 导管送至动脉瘤体1/2 处，释放弹簧圈，同时半释放支架覆盖动脉瘤颈至弹簧圈填塞致密后退出导管， 完全释放支架［9］；即刻造影确定栓塞程度、支架位置等。 若术中出现脑血管痉挛给予静脉注射用盐酸罂粟碱（30～120 mg/次，山东北大高科华泰制药公司，国药准字H20052331）处理。

1.3 外周血中单个核细胞提取

用Ficoll 密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞，操作如下：分别于介入治疗前和治疗24 h内抽取aSAH 患者空腹肘部静脉血10 mL，用磷酸盐缓冲溶液进行稀释，并将稀释液滴入Ficoll 分离液中，4℃2 000 r/min 离心20 min，吸取单个核细胞层细胞； 再次用磷酸盐缓冲溶液稀释细胞，4℃1 500 r/min 离心10 min，吸取细胞，重复该操作2 次［10］。

1.4 TRPM2 水平检测

用蛋白质免疫印迹法检测TRPM2 水平， 操作如下：用含放射免疫沉淀试验（RIPA）溶液裂解细胞，离心后提取蛋白，二辛可酸（BCA）试剂盒定量；凝胶电泳（电压80～120 V）至溴酚蓝跑出胶面，漂洗、 转膜后用脱脂奶粉室温封闭2 h； 一抗兔抗人TRPM2 多克隆抗体和兔抗人3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（武汉益普生物科技公司）4℃孵育过夜，二抗山羊抗兔IgG 多克隆抗体（武汉菲恩生物科技公司）室温孵育2 h；电化学发光（ECL）液显影，Image J 1.8.0 软件读取蛋白质免疫印迹图像［11］。计算TRPM2 相对内参GAPDH 的表达水平。

1.5 预后随访和评价

采用门诊和电话方式随访，评估aSAH 患者治疗90 d 后改良Rankin 量表（mRS）评分。 本研究随访截止时间为2021 年9 月5 日。 mRS 评分≤2 分为预后良好，＞2 分为预后不良［12］。

1.6 统计学方法

采用4.1.0 版R 软件进行统计学分析。 正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间比较用独立样本t 检验， 组内治疗前后比较用配对样本t 检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较用Mann-Whitney U 检验。 计数资料用例和率（%）表示，组间比较用χ2检验。 采用受试者工作特征曲线 （receiver operating characteristic curve，ROC）评价TRPM2 判断aSAH 预后的价值，logisti回归分析影响aSAH 预后的因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

符合纳入标准的aSAH 患者共165 例， 术后获随访148 例，随访率为89.7%。 148 例中男57 例，女91 例； 年龄范围40～64 岁， 中位年龄46（45，49）岁；体质量指数（BMI）为（25.45±2.36） kg/m2；有高血压史71 例，高脂血症史55 例，糖尿病史33 例；动脉瘤位于前循环67 例，后循环34 例，前后循环47例；Hunt-Hess 分级Ⅰ、 Ⅱ级86 例， Ⅲ级62 例；Fisher 分级Ⅰ、Ⅱ级139 例，Ⅲ级9 例；脑血管痉挛29 例；Glasgow 昏迷量表（GCS）评分为6（4，7）分。随访结束后，mRS 评分≤2 分107 例（预后良好组），＞2 分41 例（预后不良组）。

两组间性别构成、BMI、高血压史占比、糖尿病史占比、高脂血症史占比、动脉瘤位置构成和Fisher分级构成差异无统计学意义（均P＞0.05），预后良好组年龄、Hunt-Hess 分级Ⅲ级占比、脑血管痉挛占比和GCS 评分均低于预后不良组，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 两组基线资料比较

预后良好组治疗前后TRPM2 水平分别为（0.45±0.09） g/L、（0.25±0.05） g/L， 均低于预后不良组（0.51±0.13） g/L、（0.34±0.06） g/L，差异均有统计学意义（t=2.645，P=0.011；t=7.768，P＜0.01）。预后良好组、 预后不良组治疗后TRPM2 水平均低于治疗前，差异均有统计学意义（t=20.208、9.806，均P＜0.01）； 治疗前后TRPM2 水平变化值分别为0.19（0.12，0.27）和0.13（0.08，0.27），差异无统计学意义（Z=1.652，P=0.098）。 见图1。

图1 aSAH 患者治疗前后TRPM2 水平

治疗前TRPM2 判断aSAH 患者预后的ROC 曲线下面积（AUC）、最佳截断点、灵敏度和特异度分别为0.622（95%CI：0.511～0.734）、0.55、41.46%和87.85%，治疗后TRPM2 判断aSAH 患者预后的AUC、最佳截断点、灵敏度和特异度分别为0.885（95%CI：0.822～0.947）、0.28、82.93%和80.37%，治疗后TRPM2 判断aSAH 患者预后的AUC 高于治疗前TRPM2，差异有统计学意义（Z=4.672，P＜0.01）。

将aSAH 患者预后作为因变量， 年龄、GCS 评分、 治疗后TRPM2、Hunt-Hess 分级、Fisher 分级和脑血管痉挛作为自变量纳入线性回归分析（变量赋值见表2），结果显示上述因素的容忍度均大于0.1，方差膨胀因子均小于10，见表3；提示上述因素不存在共线性。将上述因素纳入多因素logistic 回归分析，结果显示GCS 评分高、治疗后TRPM2＞0.28 和Hunt-Hess 分级Ⅲ级是aSAH 患者预后的独立危险因素（P＜0.05），见表4。

表2 变量赋值

表3 各变量共线性检验结果

表4 logistic 分析aSAH 患者预后风险因素

3 讨论

准确评估aSAH 预后具有重要意义， 有助于制定患者后续治疗方案。 目前临床主要应用Hunt-Hess分级评价aSAH 患者预后［13］，但该分级各等级间划分标准的界限不清晰，受主观因素影响较大［14-15］，因此亟需探究评价aSAH 患者预后的新指标。 TRPM2是一种非选择性钙离子可渗透的阳离子通道，在机体内广泛分布，对氧化应激的激活高度敏感［16］。 氧化应激损伤一般多通过破坏细胞内离子稳态诱导细胞死亡。 多数研究表明TRPM2 在介导氧化应激诱导的细胞死亡过程中发挥着重要作用，包括脑缺血-再灌注损伤、β-淀粉样蛋白寡聚体相关神经毒性和记忆障碍、 神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子/1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶诱导的细胞死亡和破坏血管内皮功能［17-20］等。

本研究结果显示，预后良好组治疗前后TRPM2水平均低于预后不良组，提示TRPM2 与aSAH 患者预后有关，是评估其预后的潜在生物标志物；结果还显示预后良好组和预后不良组治疗后的TRPM2水平均低于治疗前， 提示介入治疗会影响aSAH 患者TRPM2 水平，但其具体原因仍需研究探明。 本研究用AUC 评价TRPM2 判断aSAH 患者预后的价值，结果显示治疗后TRPM2 判断aSAH 患者预后的AUC、 灵敏度和特异度分别为0.885、82.93%和80.37%， 治疗后TRPM2 判断aSAH 患者预后的AUC 高于治疗前TRPM2，表明治疗后TRPM2 判断aSAH 患者预后有一定价值，可辅助临床决策。

既往有研究表明，TRPM2 与炎性反应、 氧化应激及调节细胞内钙离子浓度等有关，并通过上述机制参与神经元凋亡［6-7］。 本研究中多因素logistic 回归分析结果显示，治疗后TRPM2＞0.28 是aSAH 患者预后的独立危险因素， 推测其原因是治疗后TRPM2 水平与神经元凋亡、脑部炎症和氧化应激损伤、细胞内钙离子浓度及NLRP3 炎性小体激活等有关， 上述因素均与神经元的功能和生存状态有关，因此可反映患者预后；研究结果还显示GCS 评分高和Hunt-Hess Ⅲ级是aSAH 患者预后的独立危险因素，这与既往研究［21-22］报道一致。 张鹏等［23］研究表明， 脑血管痉挛和Fisher 分级与aSAH 患者预后不良有关。 本研究结果显示脑血管痉挛并非aSAH 患者预后的独立危险因素，推测其原因与研究样本量大小有关，还需开展大样本研究予以验证。

综上所述，aSAH 患者介入治疗后TRPM2 水平高与预后不良有关。本研究尚存在一定不足，如仅分析治疗前后两个时间点的TRPM2 水平与aSAH 患者预后的关系， 后续将增加时间梯度，进一步探究； 此外， 对于接受外科手术治疗后患者TRPM2 是否可用于预后评估及其临床价值，还需进一步研究。