藏红花素对癫痫大鼠学习记忆能力的影响

江冉冉，李晓东，周蓓瀛

我国癫痫发病率为0.7%，现有病人约900万例，30%～40%的病人存在认知功能障碍，严重影响癫痫病人生活质量[1-2]。认知功能障碍多表现为学习能力低下和记忆功能受损，海马组织是学习和记忆的脑功能区域。相关研究报道，癫痫发作过程中，神经元异常兴奋与放电所致海马组织氧化应激和炎症损伤与癫痫后认知功能障碍密切相关[3-4]。

藏红花素是藏红花的主要有效成分，通过抑制氧化应激和炎症对过氧化氢所致视网膜损伤、脑缺血及脑缺血再灌注损伤发挥保护作用[5-7]。藏红花素是否对癫痫所致海马神经元损伤及学习记忆能力有保护作用文献报道较少。本研究观察藏红花素对癫痫大鼠学习记忆能力的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 通过河北省实验动物中心购买180只清洁级雄性SD大鼠[SCXK(冀)2018-004]，体质量(240±10)g，动物批号：2020031604。在温度(24±1)℃、湿度(65±10)%、明/暗各12 h交替的环境中饲养。

1.2 实验药物与试剂 藏红花素(批号：17304-1G，纯度≥98%)购自美国Sigma公司；注射用丙戊酸钠(批号：20190826)购自四川科瑞德制药股份有限公司；丙二醛(MDA)(货号：A003-1-2，批号：191026)、超氧化物歧化酶(SOD)(货号：A001-1-2，批号：191204)、过氧化氢酶(CAT)(货号：A007-2-1，批号：190917)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子(TNF)-α(货号：SEKR-0009，批号：20200105)、白细胞介素(IL)-1β(货号：SEKR-0002，批号：20191128)、IL-6(货号：SEKR-0005，批号：20190914)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自北京索莱宝生物技术有限公司。

1.3 分组、模型制备与给药 在180只雄性SD大鼠中随机取150只大鼠，参照康云霄等[8]报道的氯化锂-匹罗卡品诱导法复制实验用癫痫大鼠模型(127 mg/kg腹腔注射氯化锂、20 h后15 mg/kg背部皮下注射匹罗卡品)，随机分为癫痫组、藏红花素5 mg/kg组、藏红花素10 mg/kg组、藏红花素20 mg/kg组[9]和丙戊酸钠300 mg/kg组[10]，每组30只；其余30只大鼠作为正常组。各组均于背部皮下注射匹罗卡品前1 h腹腔注射给予相应剂量药物(癫痫组给予生理盐水)，正常组在造模和给药过程中均给予生理盐水。

1.4 癫痫首次发作潜伏期、持续时间及发作程度分级 造模完成后2 h内，观察每只大鼠癫痫首次发作潜伏期(造模完成到第1次癫痫发作的时间间隔)，记录癫痫持续时间，依据Racine分级标准[11]进行癫痫分级，Racine分级标准见表1。

表1 Racine分级标准

1.5 大鼠学习记忆能力测定 Morris水迷宫平台固定于第Ⅲ象限，水温25 ℃。氯化锂-匹罗卡品注射24 h后，每组随机选取10只大鼠，训练3 d(每日4次)后，分别于第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限使头向器壁放入水中并诱导大鼠找到第Ⅲ象限平台。①定位航行实验：将每只大鼠分别在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限头向器壁入水，记录寻到平台时间(120 s内未找到计120 s)，取平均值，即逃避潜伏期，可反映大鼠学习能力；②空间探索实验：去掉第Ⅲ象限平台，于第Ⅰ象限头向器壁入水，记录120 s内穿越原平台位置次数，反映大鼠记忆能力。

1.6 海马组织病理学检查 造模完成24 h后，各组随机另取10只大鼠，颈椎脱臼处死、取脑，4%多聚甲醛溶液固定72 h后包埋、切片、脱蜡、透明后行苏木精-伊红(HE)染色，通过光学显微镜观察海马组织病理学改变。

1.7 海马组织氧化应激和炎性因子水平测定 造模完成24 h后，将各组剩余大鼠颈椎脱臼处死，冰上取脑、研磨匀浆，4 ℃离心取上清液。部分上清液按试剂盒说明处理后，采用酶标仪检测氧化应激指标(SOD、CAT活性、MDA含量)；其余上清液按试剂盒说明处理后，采用酶标仪检测炎性因子水平(TNF-α、IL-1β、IL-6含量)。

2 结 果

2.1 藏红花素对癫痫大鼠首次发作潜伏期、持续时间及发作等级的影响 藏红花素10 mg/kg组、藏红花素20 mg/kg组和丙戊酸钠300 mg/kg组癫痫首次发作潜伏期较癫痫组延长、持续时间缩短、发作等级降低，差异有统计学意义(P<0.01)；藏红花素20 mg/kg组较丙戊酸钠300 mg/kg组癫痫首次发作潜伏期延长、持续时间缩短、发作等级降低，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表2。

2.2 藏红花素对癫痫大鼠学习记忆能力的影响 癫痫组大鼠逃逸潜伏期较正常组延长，穿越平台次数减少，差异均有统计学意义(P<0.01)；藏红花素10 mg/kg组、藏红花素20 mg/kg组和丙戊酸钠300 mg/kg组逃逸潜伏期较癫痫组缩短，穿越平台次数增多，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；藏红花素20 mg/kg组较丙戊酸钠300 mg/kg组逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见图1、表3。

图1 藏红花素对癫痫大鼠定位巡航实验轨迹的影响(A为正常组；B为癫痫组；C为藏红花素5 mg/kg组；D为藏红花素10 mg/kg组；E为藏红花素20 mg/kg组；F为丙戊酸钠300 mg/kg组)

2.3 藏红花素对癫痫大鼠海马组织病理学改变的影响 正常组大鼠大脑海马组织形态结构未见异常；癫痫组可见细胞排列紊乱，核膜核仁边界不清，胞浆固缩深染、空泡变性等病理学改变；藏红花素5 mg/kg组、藏红花素10 mg/kg组、藏红花素20 mg/kg组和丙戊酸钠300 mg/kg组大鼠大脑海马组织病理学改变较癫痫组均有所改善，藏红花素20 mg/kg组优于其余组。详见图2。

图2 藏红花素对癫痫大鼠海马组织病理学改变的影响(HE，×400)(A为正常组；B为癫痫组；C为藏红花素5 mg/kg组；D为藏红花素10 mg/kg组；E为藏红花素20 mg/kg组；F为丙戊酸钠300 mg/kg组)

2.4 藏红花素对癫痫大鼠海马组织MDA含量和SOD、CAT活性的影响 癫痫组大鼠海马组织MDA含量较正常组升高，SOD、CAT活性较正常组降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；藏红花素10 mg/kg组、藏红花素20 mg/kg组和丙戊酸钠300 mg/kg组较癫痫组MDA含量降低，SOD、CAT活性升高，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；藏红花素20 mg/kg组较丙戊酸钠300 mg/kg组MDA含量降低，SOD活性升高，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表4。

2.5 藏红花素对癫痫大鼠海马组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影响 癫痫组海马组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量较正常组升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；藏红花素10 mg/kg组、藏红花素20 mg/kg组和丙戊酸钠300 mg/kg组较癫痫组TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；藏红花素20 mg/kg组较丙戊酸钠300 mg/kg组TNF-α、IL-6含量降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见表5。

单位：pg/mL

3 讨 论

癫痫具有自发发作和反复发作的特点，病程迁延，常导致认知功能障碍，严重影响癫痫病人生活质量，造成心理负担。癫痫及其并发症病理机制复杂，既往研究证实癫痫发作过程导致海马神经元氧化应激和炎症损伤是引发认知功能障碍的重要因素。因此，抑制氧化应激和炎症为切入点探讨保护海马神经元的药物，是提高癫痫病人学习记忆能力的有效方法。

藏红花取其花柱上部及柱头入药，性平味甘微酸，《本草纲目》记载：“藏红花具活血之功效，可治惊悸”，《品汇精要》记载：“藏红花主散郁调血，宽胸膈，开胃进食”。藏红花素是藏红花主要活性成分之一，可通过血脑屏障。有研究报道，藏红花素可抑制氧化应激和炎症损伤，对脑缺血再灌注损伤发挥一定的保护作用[7]。丙戊酸钠是临床广泛应用的不含氮抗癫痫药物，对各种类型癫痫小发作、大发作、阵挛性癫痫、混合型发作等均具有抑制作用，是癫痫动物实验常用的阳性对照药物[12]。本研究采用氯化锂-匹罗卡品诱导复制实验性癫痫大鼠模型，注射匹罗卡品前给予不同剂量的藏红花素或丙戊酸钠进行干预，结果显示，藏红花素可延长癫痫发作潜伏期，缩短持续时间，降低发作等级，改善海马组织病变，且藏红花素20 mg/kg组效果优于丙戊酸钠300 mg/kg组，提示藏红花素具有抗癫痫和海马组织保护作用。

尹小花等[13]研究报道，癫痫发作过程神经元异常兴奋和异常放电导致活性氧簇大量生成，引起内源性抗氧化酶SOD、CAT等过度消耗，活性氧簇不能及时被还原清除而攻击破坏核酸、多肽、蛋白质等生物大分子及生物膜脂质双分子层结构，即氧化应激损伤，且该过程将生成具有毒性的MDA[14-15]。神经元异常兴奋可刺激炎性因子过度释放，引发炎症进而导致海马组织损伤。TNF-α、IL-1β可趋化粒细胞、小胶质细胞等，进一步分泌炎性因子，进而加重炎症损伤[16-17]；IL-6能诱导活性氧簇释放，进一步加重氧化应激损伤[18]。本研究结果显示，藏红花素可提高癫痫大鼠海马组织抗氧化酶活性，降低MDA和炎性因子含量，藏红花素20 mg/kg组对SOD活性和MDA、TNF-α、IL-6含量的影响优于丙戊酸钠300 mg/kg组，提示藏红花素对癫痫大鼠海马组织的保护作用可能与抑制氧化应激和炎症有关。

综上所述，藏红花素可能通过抑制氧化应激和炎症反应，减轻癫痫大鼠海马组织损伤，对癫痫大鼠学习记忆能力发挥保护作用，本研究结果为藏红花素防治癫痫所致认知功能障碍提供了理论依据。