水蛭素对缺血性脑卒中大鼠微血管新生及HIF-VEGF-Notch通路的影响

于心洋，刘云平，张贺齐，尚淑玲

缺血性脑卒中是由于血管阻塞，血流量减少，引起脑供血不足、脑组织损伤的一类疾病，以脑组织坏死引起的神经功能损伤为主要表现。缺血性脑卒中患病率高，具有较高的致死率、致残率，严重危害人类生命与健康[1]。缺血性脑卒中早期，若及时恢复血供，促进缺血区新生血管形成，不仅有利于变性神经元修复，并且可为神经元功能的重塑提供良好的微环境，促进病人脑组织损伤及对神经功能恢复[2]。脑组织缺血后，激活缺氧诱导因子(HIF)-血管内皮生长因子(VEGF)-Notch信号通路，可介导微血管代偿性再生，是调节缺血性脑卒中病人微血管新生的重要作用靶点[3]。水蛭素为水蛭的主要有效成分，具有抗凝、抗血栓、抑制炎症反应、抗氧化等多种药理作用，治疗脑血管疾病疗效显著[4]。相关研究表明，水蛭素能减轻脑组织微血管内皮细胞损伤，改善血肿周围神经细胞损伤，并抑制细胞凋亡[5]。本研究通过线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型(MCAO)，观察水蛭素对MCAO大鼠脑组织微血管新生的影响及神经损伤的保护作用，并探讨其调节HIF-VEGF-Notch信号通路的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠120只，雄性，无特定病原体(SPF)级，体质量180～220 g，实验前在25 ℃、50%相对湿度的环境中适应性饲养1周，自由进食、进水，定时更换垫料。

1.2 实验试剂 水蛭素(酵母重组)购自Calbiochem公司；尼莫地平购自山东新华制药股份有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)试剂购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗大鼠CD31+抗体试剂盒，羊抗大鼠IgG-生物素，二氮基联苯胺(DAB)试剂盒购自武汉博士德公司；HIF-1α、VEGF、Notch1、磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)鼠单克隆抗体购自Santa Crutz公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与给药 将120只SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、阳性对照组、水蛭素低剂量组及水蛭素高剂量组，每组20只。除空白组外其余各组大鼠接受MCAO造模，造模结束后，水蛭素低剂量组、水蛭素高剂量组分别给予水蛭素0.5 mg/kg、1.0 mg/kg腹腔注射，阳性对照组给予尼莫地平1.0 mg/kg腹腔注射，假手术组及模型组给予等体积生理盐水腹腔注射，每日1次，持续7 d。空白组大鼠不进行处理。

1.3.2 MCAO模型制备 以血管内栓线阻断法构建MCAO大鼠模型[6]。腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，仰卧位固定，75%乙醇消毒颈部皮肤，于颈部正中纵向切开皮肤，作一1 cm切口，分离并暴露左侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，应用缝合线结扎颈总动脉及颈外动脉近心端，同时使用动脉夹暂时阻断颈内动脉，距颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉分叉约5 mm处剪一小口，将栓线由颈总动脉插入颈内动脉，阻断大脑中动脉血流，之后逐层缝合切口，造模完成。假手术组仅分离上述血管而不结扎。

1.3.3 神经行为学评分 参照文献[7]对大鼠神经功能进行评定。无神经功能异常症状计0分；将鼠尾提起时缺血侧前肢不能完全伸展计1分；不能直行，行走时向对侧转圈计2分；行走困难，行走时向对侧倾斜计3分；出现意识障碍，无法自发行走计4分，1～4分视为造模成功，将术中意外死亡及造模未成功大鼠剔除实验，并随机选取大鼠补充。实验结束24 h后对各组大鼠进行神经行为学评分评定。

1.3.4 脑组织含水量测定 各组随机选取5只大鼠，采用干/湿重法测定大鼠脑组织含水量。于神经行为学评分结束后，给予水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，断头处死，取脑组织，定性滤纸吸干水分及血渍后立即称重，即得湿重。置入60 ℃恒温箱内干燥72 h，取出反复称重直至2次干重之差<0.3 mg，即得干重。计算脑组织含水量：脑组织含水量=(脑组织湿重-脑组织干重)/脑组织湿重×100%。

1.3.5 脑梗死体积测定 各组随机选取5只大鼠测定脑梗死体积。实验结束后，大鼠给予水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，断头处死，取脑组织，生理盐水冲洗后置于定性滤纸上吸干水分，-20 ℃冰箱内冷冻20 min后取出，脑组织每隔2 mm作一冠状切片，采用2%的TTC染液37 ℃下避光孵育30 min，经磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗后，4%多聚甲醛溶液固定24 h。将大脑切片取出，肉眼观察并拍照，使用Image Pro软件分析大鼠脑梗死体积。正常脑组织染为红色，脑梗死组织为白色或未染色区域。脑梗死体积(%)=脑梗死面积/脑切片面积×100%。

1.3.6 脑组织微血管密度测定 各组随机选取5只大鼠，采用免疫组织化学法测定大鼠脑组织CD31表达检测微血管密度(MVD)。将大鼠断头取脑，脑组织置于4%甲醛溶液中，4 ℃下固定24 h，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后切片。切片进行脱蜡，二甲苯透明，梯度乙醇脱水后，使用0.3% 的H2O2室温封闭20 min，蒸馏水冲洗后进行抗原热修复，5%胎牛血清白蛋白(BSA)封闭20 min，一抗4 ℃过夜，二抗37 ℃孵育20 min，链霉柔和素-生物素复合物(SABC)37 ℃孵育20 min后DAB显色剂显色，蒸馏水冲洗后封片，光学显微镜下观察CD31阳性细胞比例并拍照，根据Weidner微血管计数法统计各组MVD[8]，使用低倍光学显微镜扫视整张切片，找到微血管数量最密集的3个区域，在400倍视野下计数阳性血管数量，计算3个视野平均值作为MVD。

1.3.7 脑组织HIF-1α、VEGF、Notch1蛋白表达测定 各组随机选取5只大鼠，采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测脑组织HIF-1α、VEGF、Notch1蛋白表达。取各组大鼠脑组织100～200 mg，剪碎后置于RIPA裂解液中，冰上匀浆后提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，进行制胶、上样、电泳、转膜、封闭后，HIF-1α、VEGF、Notch1一抗溶液4 ℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗室温孵育2 h，TBST洗膜。电化学发光(ECL)液显色，凝胶成像仪曝光拍摄后，Image J软件测定灰度值，计算HIF-1α、VEGF、Notch1蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 水蛭素对神经功能及脑组织含水量的影响 空白组及假手术组未见神经功能缺陷。与空白组比较，模型组神经行为学评分升高(P<0.01)。与模型组比较，水蛭素低剂量组、水蛭素高剂量组及阳性对照组神经行为学评分均降低(P<0.05或P<0.01)。与空白组比较，模型组大鼠脑组织含水量升高(P<0.01)，水蛭素低剂量组、水蛭素高剂量组及阳性对照组脑含水量较模型组降低(P<0.05或P<0.01)。详见表1。

表1 各组大鼠神经行为学评分及脑组织含水量比较(±s)

2.2 水蛭素对脑梗死体积的影响 空白组及假手术组大鼠脑组织未见梗死灶。与空白组比较，模型组大鼠脑梗死体积增加(P<0.01)。水蛭素低剂量组、水蛭素高剂量组及阳性对照组较模型组梗死体积减小(P<0.05或P<0.01)。详见图1、表2。

图1 各组大鼠脑梗死体积(A为空白组；B为假手术组；C为模型组；D为水蛭素低剂量组；E为水蛭素高剂量组；F为阳性对照组)

表2 各组大鼠脑梗死体积比较(±s) 单位：%

2.3 水蛭素对缺血区微血管密度的影响 免疫组化结果显示，空白组及假手术组大鼠脑组织CD31阳性染色细胞散在分布。与空白组比较，模型组阳性染色细胞增多，MVD升高(P<0.05)。水蛭素低剂量组、水蛭素高剂量组及阳性对照组阳性染色细胞较模型组增多，MVD升高(P<0.05或P<0.01)。详见图2、表3。

图2 各组大鼠脑组织CD31蛋白表达光镜图(×400)(A为空白组；B为假手术组；C为模型组；D为水蛭素低剂量组；E为水蛭素高剂量组；F为阳性对照组)

表3 各组大鼠微血管密度比较(±s) 单位：个

2.4 水蛭素对脑组织HIF-1α、VEGF、Notch1表达的影响 与空白组比较，假手术组大鼠脑组织HIF-1α、VEGF、Notch1蛋白表达无明显变化(P>0.05)。模型组较空白组HIF-1α、VEGF、Notch1表达升高(P<0.05)。与模型组比较，水蛭素低剂量组、水蛭素高剂量组及阳性对照组HIF-1α、VEGF、Notch1表达升高(P<0.05或P<0.01)。详见图3。

模型组与空白组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05，△P<0.01。图3 各组大鼠脑组织HIF-1α、VEGF、Notch1表达比较柱状图(A为空白组；B为假手术组；C为模型组；D为水蛭素低剂量组；E为水蛭素高剂量组；F为阳性对照组)

3 讨 论

缺血性脑卒中发病早期局部神经元发生可逆性变性，此时若能及时恢复血供，促进缺血区新生血管形成，不仅有利于变性神经元修复，同时为神经元功能重塑提供良好的微环境，从而减轻脑损伤，保护脑组织，促进病人神经功能恢复，并改善预后[2]。

血管新生是指在原有毛细血管及毛细血管后静脉基础上发展形成新的功能性血管过程[9]。缺血性脑卒中发生发展过程中，微血管新生可改善缺血区域血液循环，增加脑组织变性和神经元微循环血量，抑制神经元凋亡，通过分泌多种细胞因子，营养受损神经元，促进神经功能恢复[10]。有研究表明，脑梗死病人脑组织新生血管可改善脑缺血区血流灌注，促进神经功能恢复[11]。因此，有效促进缺血区微血管新生对恢复缺血性脑卒中病人神经功能尤为重要。新生血管过程中，血管生长因子发挥着重要的作用，其中以VEGF作用显著[12]。VEGF是一种特异性促血管内皮细胞生长因子，实验研究表明，缺血缺氧后通过VEGF受体特异性作用于血管内皮细胞，可刺激内皮细胞增殖分化及迁移，促进血管生成及血管通透性增加，通过上调VEGF表达发挥促血管生成的作用[13]。Notch信号传导途径在血管新生中发挥着重要的调控作用。Notch及受体在血管新生过程中均表达于内皮细胞。脑缺血时，通过升高Notch受体Notch1表达，促进微血管再生，进而保护脑组织，减轻脑损伤[14-15]。缺血缺氧后，VEGF诱导Notch1活化，同时Notch又抑制VEGF受体VEGFR2表达[16]。有研究证实，阻断VEGF后，Notch及其配体DLL4表达减少，同时抑制新生血管生成[17]。可见VEGF和Notch相互调控，在缺血后血管新生中发挥作用。HIF-1是一种转录调节因子，在缺血动物模型中，HIF-1可激活下游靶因子，促进新生血管形成[18]。VEGF是HIF-1的下游靶基因，缺血缺氧后，HIF-1直接作用于VEGF，参与血管系统形成[19]。机体发生脑缺血时，HIF-VEGF-Notch信号通路的激活可介导微血管代偿性再生，进而促进局部血液循环，减轻脑损伤，是调节缺血性脑卒中微血管新生的重要作用靶点。

水蛭又名蚂蟥，性味苦咸而平，属“血肉有情之品”，具有破血逐瘀、通经达络、散结消癥的功效。水蛭善于化瘀血而不伤新血，治疗脑血管疾病疗效显著，对缺血性脑卒中所致脑损伤有明显的修复作用[20]。水蛭素为水蛭的主要有效成分，具有抗凝、抗血栓、抑制炎症反应、抗氧化等多种药理作用，可用于各类心脑血管疾病的防治[21]。有研究表明，水蛭素与凝血酶特异性结合，通过下调凝血酶介导的水通道蛋白4(AQP4)表达，改善脑出血大鼠血脑屏障通透性，降低脑组织含水量，发挥改善脑水肿的作用[22]。有研究显示，水蛭素可减轻凝血酶所致的脑组织微血管内皮细胞损伤，改善血肿周围神经细胞损伤，抑制细胞凋亡[5]。

本研究采用线栓法制备大鼠MCAO模型，观察不同浓度水蛭素对MCAO大鼠神经功能及微血管新生的影响，并探讨其通过HIF-VEGF-Notch通路发挥作用的潜在机制。结果显示，与模型组比较，水蛭素能改善MCAO大鼠神经功能缺陷，减少脑梗死体积，降低脑组织含水量。CD31(血小板内皮细胞黏附分子)是内皮细胞紧密连接处的一种重要膜分子，与血管生成关系密切，作为微血管生成的标志物，可反映MVD大小。免疫组化结果显示，模型组大鼠脑组织CD31阳性表达较空白组增加，脑部MVD升高，表明大鼠脑组织微血管代偿性再生，提示模型构建成功。水蛭素低剂量组、水蛭素高剂量组CD31阳性表达进一步增多，MVD较模型组升高，表明水蛭素可促进MCAO大鼠脑组织微血管形成。Western Blot结果显示，模型组HIF-1α、VEGF、Notch1表达较空白组升高。水蛭素低剂量组、水蛭素高剂量组HIF-1α、VEGF、Notch1表达较模型组升高，提示水蛭素对MCAO大鼠的神经保护及促血管新生作用可能与调控HIF-VEGF-Notch信号通路有关。

综上所述，水蛭素可激活HIF-VEGF-Notch通路，减小MCAO大鼠脑梗死面积，降低脑含水量，促进缺血后微血管新生，改善大鼠神经功能障碍，上调HIF-VEGF-Notch信号通路表达可能是其潜在的作用机制之一。

志谢：感谢华北理工大学基础医学院段钰泽老师在实验研究中提供的帮助。