响应面法优化发酵对桑叶蛋白含量的影响

樊 杰，郝祥蕊，吴小珍，李 慧，张红艳，冯镇泰

(上海农乐生物制品股份有限公司，上海 201419）

桑叶在我国种植面积十分广阔，其具有非常高的营养与应用价值。经权威机构检测，新鲜的桑枝叶蛋白质含量在12.8%～28%之间，干桑叶粉中粗蛋白质的含量也在10.6%以上，且氨基酸种类齐全，维生素含量也十分丰富，同时还含有许多生物活性成分。国内外学者对桑叶饲用的研究十分广泛。发酵后的桑叶贮藏时间明显加长且营养物质显著增加，而有毒物质被大量消除，提升了饲料品质和口感。研究发现，采用菌种协同发酵处理，可以提高植物饲料的蛋白含量和营养品质。桑叶经发酵后，粗纤维等难以吸收的大分子物质含量显著降低，利于动物吸收的小分子营养物质等显著升高，同时，桑叶中的生物活性物质的含量及组成也得到了修饰和优化，极大地改善了动物的适口性。目前市面上蛋白桑发酵剂品种很多，从功用上分为乳酸菌发酵剂和复合发酵剂。复合发酵剂含有多种益生霉菌（米曲霉、黑典霉)、软酸菌(植物乳酸菌、干酪乳酸菌、嗜酸乳酸菌等)和酵母菌，可产生多种消化酶，降低桑叶中的粗纤维含量，从而增加了桑叶饲料中的粗蛋白质含量。徐丹等发现，混合发酵桑叶粗蛋白含量有明显提升，增加了23.26%。叶添梅等采用固态发酵桑叶粉的方法，发酵后蛋白质含量达到27.22%。

Plackett-Burman 是一种基于非完全平衡块原理的近饱和的两水平试验设计方法。通过N 次试验最多可以考察N-1 个因素，用最少试验次数可以从众多因素中快速有效地筛选出最为重要的几个主效因子，响应面分析是利用统计学和数学模型的方法对需要优化的多因素系统进行建模和分析，Box-Behnken 试验设计是其中拟合模型之一，目前常被用于生物发酵过程培养基和培养条件的优化。由于多种菌混合培养，易出现污染、混菌比例难控制等问题，而枯草芽孢杆菌被允许用于动物养殖，应用其进行试验可以避免这些问题因扰。因此，本研究选择实验室已鉴定出的枯草芽孢杆菌发酵桑叶，利用响应面法摸索发酵工艺和发酵条件，提高蛋白含量，为饲料桑产业的后续开发，桑蛋白的利用提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料及主要试剂

1.1.1 桑叶 2021 年8 月在上海农乐生物制品股份有限公司试验桑园采摘桑叶（品种为‘ 丰驰桑’）。挑选大小匀称、无明显病虫害的叶片，用清水冲洗干净，自然晾干表面水分后去除叶柄，在55 ℃下干燥24 h，利用粉碎机粉碎后过80 目筛，常温保存备用。

1.1.2 供试菌株 枯草芽孢杆菌hij158(Bacillus subtilis)，由本实验室分离保藏。

1.1.3 种子液培养基 牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0 g，骨蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，加蒸馏水定容至1 L，调节pH 值至7.0～7.2)。

1.2 发酵种子液的制备

选取直径约为3 mm 的菌落进行平板划线，28 ℃过夜培养，选择单菌落挑取1 环至装有50 mL 培养基的三角瓶（250 mL）中，200 r·min，培养18 h，制成菌株种子液，测定其菌落形成单位（CFU），该种子液CFU 为5×10个·mL。

1.3 桑叶发酵的基础方法

在100 mL 三角瓶中加入20 g 粉碎后的桑叶粉，将不同的营养成分加入蒸馏水中进行溶解，然后将桑叶粉与上述溶液进行混合，混合比例根据试验设计要求进行，121 ℃灭菌20 min，冷却至室温后，接入适量的种子液，搅拌混匀后进行发酵。发酵条件及各成分比例根据试验要求进行设计。

1.4 粗蛋白质的测定

参照GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》测定氮含量，相关结果乘以蛋白质折算系数6.25，计算粗蛋白含量。

1.5 桑叶发酵工艺条件的优化试验

1.5.1 Plackett-Burman（PB）试验设计 根据前期试验结果，利用PB 设计对影响桑叶发酵后粗蛋白含量的11 个因素进行筛选，包括蔗糖（A）、柠檬酸钠（B）、硫酸铵（C）、磷酸氢二钾（D）、磷酸二氢钾（E）、硫酸镁（F）、发酵时间（G）、发酵温度（H）、pH 值（I）、接种量（J）、料水比（K）。各因素设置高（+1）和低（-1）2 个水平。共设计12 组测试，每组3 个重复，响应值为发酵后测得的粗蛋白含量。根据各因素的贡献率大小进行显著因素筛选，选择效果更显著的因素进行下一步试验。

1.5.2 最陡爬坡试验 根据PB 试验筛选出的因素，以各因素的正负效应、大小进行爬坡试验，确定中心点，得到最大响应值。

1.5.3 Box-Behnken 试验设计 最陡爬坡试验所得最佳响应区域作为Box-Behnken 试验设计的中心点，各因素取3 个水平，以（-1，0，1）表示，设计包括了5 个中心点（0，0，0），共17 个组合的响应面试验。各处理3 次重复。

1.6 结果验证和数据统计分析

根据Box-Behnken 试验结果，进行方差分析，并拟合线性回归方程，检验拟合方程的符合程度；利用拟合方程获得最佳培养条件，并在最佳培养条件下进行验证试验。数据处理和作图使用Excel 2016，统计分析使用Design Experts 10 和IBMSPSS 22。试验结果以平均值±标准差形式表示。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman 设计

在Plackett-Burman 设计试验中，12 个组的粗蛋白含量在183.1～226.8 mg·g，通过统计软件分析确定最优配方组合及条件为组合2，此时发酵条件为蔗糖8%、柠檬酸钠1%、硫酸铵1%、磷酸二氢钾0.1%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.05%、发酵时间10 d、发酵温度28 ℃、初始pH 值为8、接种量为15%、桑叶粉与混合溶液质量体积比为1∶0.5(W/V)，在此条件下发酵得到的粗蛋白含量为226.8 mg·g（表1）。

表1 Plackett-Burman 设计各因素得编码值及试验结果

由表2 可以看出，硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、发酵时间、接种量对提高桑叶发酵后粗蛋白含量具有正效应，蔗糖、柠檬酸钠、硫酸镁、温度、pH值、料水比具有负效应。影响因素最大的分别为温度、硫酸铵和蔗糖。发酵温度显著影响菌种的生长速度，提供充足的碳源和氮源能显著促进菌株的生长。

表2 Plackett-Burman 设计试验因素水平表

由表3 可以看出，根据9 个因素（分别为蔗糖质量浓度、柠檬酸钠质量浓度、硫酸铵质量浓度、硫酸镁质量浓度、发酵时间、发酵温度、接种量、料水比）预测的线性模型具有极显著性（P＜0.01），表明该模型拟合度较高，可信度大于99%。其中相关系数R为0.9989，校正决定系数R为0.994 0，说该模型能解释99.89%出现的变化。根据Plackett-Burman 设计以及显著性方差分析得出，在11 个因素中发酵温度、硫酸铵浓度和蔗糖浓度对桑叶发酵结束后粗蛋白含量影响最大，因此选择这3 个因素进行进一步优化。

表3 采用Plackett-Burman 设计筛选影响粗蛋白含量的重要显著因素

2.2 最陡爬坡试验确定因素水平

由Plackett-Burman 设计的试验结果可以看出，蔗糖、硫酸铵、温度对桑叶发酵影响最显著，故选取这3 个因素进行最陡爬坡试验。根据上述试验结果，将其他因素固定在最佳水平，采用最陡爬坡试验的方法，对蔗糖（A）、硫酸铵（C）、温度（H）3 个因素在各自合适的方向上进行最陡爬坡，以获得这3 个因素的最佳中心点。根据这3 个因素的效应大小比较设定它们的变化方向和步长，由表4 可知，当蔗糖添加量为6%、硫酸铵1.5%、温度为30 ℃时，粗蛋白含量最高为241.3 mg·g。故Box-Behnken design 试验选择以第3 组的条件作为中心点。

表4 最陡爬坡试验试验结果

2.3 Box-Behnkendesign试验筛选主要因素的最优水平

根据最陡爬坡试验结果设计Box-Behnken design 试验的因素和水平。蔗糖浓度分别设置7%，6%，5%作为高、中、低水平；硫酸铵浓度分别设置2%，1.5%，1%作为高、中、低水平；温度分别设置33，30，28℃作为高、中、低水平，具体设计情况见表5。根据Box-Behnken design 试验设计原理，进行三因素三水平的响应面分析试验，17 个试验点可以分为2 类：一是析因点；二是零点。零点试验重复5 次，用以估计试验误差。由表5 可知，Box-Behnken design 设计的17 组试验中，粗蛋白含量的变化范围为206.8～257.5 mg·g；零点重复试验中，粗蛋白含量值范围为255.8～257.5 mg·g；第1 组试验检测到最大值257.5 mg·g，此时蔗糖浓度为6%，硫酸铵浓度为1.5%，温度为30 ℃。经回归拟合后，试验因素对响应值的影响可以用以下回归方程表示：

式中，Y 表示预测的粗蛋白含量；A、C、H 分别代表蔗糖浓度、硫酸铵浓度和发酵温度的编码值。结果显示，不同处理的预测结果和测试结果有一定偏差，但相差不多，表明该预测模型较为准确（表5）。

表5 Box-Behnken 设计中各变量水平及检测值

以发酵后粗蛋白含量为响应值，对该模型进行显著性方差分析。结果表明，该模型差异极显著（P＜0.01），能够对菌株hij158 发酵桑叶后粗蛋白含量进行准确预测。R为0.974 8，校正决定系数R为0.940 4，两者间误差较小。3 个因素对响应值的影响顺序为：温度＞硫酸铵＞蔗糖，且3 者对粗蛋白含量的影响均极显著（表6）。

表6 根据响应面二次模型对影响粗蛋白含量的因素进行方差分析

三维响应面因素和响应值所构成的曲面图，直观地展示出不同因素交互作用对响应值的影响和变化范围。利用回归方程绘制粗蛋白含量随各因素变化的二维等高线图和三维响应面图（图1）。三维响应面和二维等高线图可以看出温度对粗蛋白含量的影响要大于蔗糖和硫酸铵，但两因素之间不存在明显的相互作用，即其中一个因素对粗蛋白含量的影响作用并不会随着另一个因素的变化而变化。

图1 双因素互作对粗蛋白含量影响的响应面图和等高线图

2.4 优化结果验证

为了检验试验模型及优化结果的可靠性，对预测的优化条件进行验证，经过3 次重复测试，每次设置3 个重复，粗蛋白含量均值为246.8 mg·g，与预测值256.6 mg·g接近，较优化前157.5 mg·g提高了1.57 倍。此时最佳发酵条件为：蔗糖6%、柠檬酸钠0.5%、硫酸铵1.5%、磷酸二氢钾0.2%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.05%、发酵时间10d、发酵温度30℃、初始pH 值为8、接种量为15%、桑叶粉与混合溶液质量体积比为1∶0.5(W/V)。综上所述，回归方程能够在一定范围内反映各因素对菌株hij158 发酵桑叶后粗蛋白含量的影响，应用响应面设计优化固态发酵培养基以提高桑叶发酵后粗蛋白含量的方案切实可行，使用的模型能够准确预测发酵最终粗蛋白含量。

3 结论与讨论

桑树是我国列入饲料目录的作物，是一种开发前景十分广阔的饲料，含有丰富的营养物质，其粗蛋白含量较高，可用于填补我国蛋白饲料资源匮乏的缺口。因此，粗蛋白含量是评价饲料品质和桑树品种的重要指标。丁佐龙对安徽的7 个桑树品种进行了桑叶粗蛋白测定，其含量分布在16.8%～23.02%；郑莎等测定了45 个桑资源，其粗蛋白含量分布在13.61%～24.97%之间。粗蛋白含量除了与品种有关，还与季节、水肥管理、叶位相关，因此，本研究选用了树龄相同，同时保证在相对一致的栽培条件下来评价发酵桑叶的粗蛋白含量。

利用微生物发酵技术，能显著改善饲料的品质，增强动物机体免疫功能、促进动物体内的微生态平衡，从而提高动物抗病能力，具有十分广阔的应用前景。桑叶经过微生物发酵后，发酵菌种可以分泌丰富的酶类以及各种活性物质，将一些难以消化分解的大分子物质降解成易于消化的蛋白质和游离氨基酸，一些微生物能通过不同的生理活动将非蛋白氮化为菌体蛋白，提高真蛋白含量。有学者研究发现，在玉米青贮饲料发酵过程中添加一定量枯草芽孢杆菌能够显著提高最终的粗蛋白含量。胡仁建等利用枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、啤酒酵母发酵桑叶，桑叶蛋白含量由14.7%提高至19.6%。任元元等利用植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、米曲霉按照1∶1∶1∶1 的添加比例进行复合菌种发酵桑叶，桑叶蛋白含量由6.2%提高至17.2%。朱佳文等研究发现，添加枯草芽孢杆菌能够使青贮桑叶中的粗蛋白含量显著提高，而抗营养因子、粗纤维和粗脂肪的含量有所下降，发酵品质得到显著改善。现阶段发酵桑叶使用的发酵菌种繁多，发酵工艺多样，多种益生菌微生物复合发酵剂虽然比单菌剂有一定优势，但是多种菌混培养，易出现污染、混菌比例难控制等问题。如细菌的培养温度一般为28～37 ℃、酵母菌的培养温度为25～30 ℃、霉菌的培养温度为25～28 ℃，不同菌的培养温度和培养时间很难统一，微生物代谢过程很难做到精准控制。选择单一菌种发酵容易控制其生长曲线和代谢过程，芽孢杆菌是益生型细菌，具有良好的益生特性和热稳定性，在不良环境中具有非常强的抗逆性，许多研究表明，芽孢杆菌饲料添加剂对动物生产具有有益的影响。利用芽孢杆菌发酵饲料的研究十分广泛。枯草芽孢杆菌能产生强抗逆性的孢子，具有耐热、耐紫外、耐干燥的特性，无致病性，可以产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等多种酶类。我国农业部颁发的《饲料添加剂品种目录（2013）》中写明枯草芽孢杆菌可用于动物饲料。

本研究选择枯草芽孢杆菌进行单菌种发酵，提高了发酵后桑蛋白含量，使用Design Experts 10 软件结合Plackett-Burman 试验、最陡爬坡试验以及Box-Behnken 试验优化了桑叶发酵条件，测试的11个因素中，蔗糖质量浓度、硫酸铵质量浓度、发酵温度显著影响桑叶发酵后的蛋白含量（P＜0.05），影响大小顺序为：发酵温度＞硫酸铵质量浓度＞蔗糖质量浓度，确定最优发酵条件为蔗糖质量浓度为6%、硫酸铵1.5%、发酵温度30 ℃，粗蛋白含量达到246.8 mg·g，较优化前157.5 mg·g提高了1.57 倍。本研究对饲料桑产业的后续开发，桑蛋白的利用具有一定的借鉴意义。