circ_0006174靶向调控miR-876-3p对肺癌细胞恶性生物学行为的影响

杨祎明，霍前伦

安徽医科大学附属六安医院胸心外科，安徽六安 237005

肺癌是一种发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤，由于其起病较为隐匿，大多数患者就诊时已处于中晚期，预后较差。目前，肺癌发病的分子机制尚未完全阐明，临床缺乏有效的靶向治疗策略。环状RNA（circRNA）是一类具有环状结构的RNA转录本，因其具有高度保守性、特异性和稳定性等，近年来备受关注。circ_0006174 是circRNA 家族成员之一。有研究报道，在结直肠癌细胞中circ_0006174表达上调，circ_0006174可能通过竞争性吸附miR-142-3p上调X连锁凋亡抑制蛋白表达，进而促进结直肠癌的发生、发展［1］。但circ_0006174在肺癌中的作用尚不明确。miRNA是一种内源性非编码单链小分子RNA，可参与多种恶性肿瘤的发生、发展。miR-876-3p 是miRNA家族成员之一。有研究报道，miR-876-3p在肺癌细胞中表达下调，其表达上调则能抑制肺癌细胞的恶性生物学行为［2］。Circular RNA Interactome在线软件预测显示，circ_0006174能够靶向调控miR-876-3p。但circ_0006174 是否通过靶向调控miR-876-3p 参与肺癌的发生、发展尚不清楚。为此，2020 年4 月—2021年12月，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌A549细胞（以下称A549细胞），由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。circ_0006174 小干扰RNA（si-circ_0006174）及其阴性对照序列（si-NC）、miR-876-3p 抑制序列（anti-miR-876-3p）及其阴性对照序列（anti-miR-NC）、circ_0006174 野生型（WT）和突变型（MUT）荧光素酶报告基因载体，由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。Varioskan LUX 多功能酶标仪、Applied Biosystems 实时荧光定量PCR 仪，购自美国Thermo 公司；FACSCanto Ⅱ流式细胞仪，购自美国Bio-Rad 公司。SuperScript 逆转录试剂盒、SYBR Green Ⅰ试剂盒，购自大连宝生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒、CCK-8 试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH 一抗及HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗，购自英国Abcam公司。

1.2 细胞传代培养 将A549 细胞接种于含10%FBS的RPMI 1640培养液，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。每2天更换一次培养液。待细胞生长融合至85%左右时，0.25%胰蛋白酶消化传代。取传5代、对数生长期A549细胞进行后续实验。1.3 细胞转染 取传5 代、对数生长期A549 细胞，以3 × 104个/孔接种至6 孔板，随机分为si-circ_0006174 组、si-NC 组、si-circ_0006174 + anti-miR-876-3p 组、si-circ_0006174+anti-miR-NC 组，每组设6 个复孔。然后将6 孔板置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养24 h，按LipofectamineTM2000 试剂盒说明，si-circ_0006174 组转染si-circ_0006174、si-NC 组转染si-NC、si-circ_0006174 + antimiR-876-3p组转染si-circ_0006174和anti-miR-876-3p，si-circ_0006174+anti-miR-NC组转染si-circ_0006174和anti-miR-NC。转染12 h，收集细胞，采用TRIzol 法提取细胞总RNA。按SuperScript逆转录试剂盒说明将总RNA 逆转录为cDNA。以cDNA 为模板，按SYBR Green Ⅰ试剂盒说明进行PCR扩增。引物序列：circ_0006174 上游引物5"-TTCTGAACCTGCACCTGCTA-3"、下游引物5"-GTGGACACTGCTTTGGGTTTG-3"，GAPDH上游引物5"-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3"、下游引物5"-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3"；miR-876-3p 上游引物5"-CTGTGGTGGTTTACAAAGTAATT-3"、下游引物5"-GTGCAGGGTCCGAGGT-3"，U6上游引物5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"、下游引物5"-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。PCR反应体系共20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O补足至20 μL；反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s 共35 个循环。以GAPDH 或U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算circ_0006174、miR-876-3p相对表达量。

1.4 细胞增殖检测 采用CCK-8 法。收集各组转染12 h细胞，接种至96孔板，每孔3×104个，然后将96 孔板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养24 h，每孔加CCK-8 试剂10 μL，37 ℃孵育2 h。酶标仪于450 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值，按公式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（对照孔OD450值-实验孔OD450值）/对照孔OD450值×100%。

1.5 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。收集各组转染12 h细胞，接种至6孔板，每孔3×104个，然后将6孔板置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养24 h，加入结合缓冲液重悬细胞后，依次加入Annexin V-FITC 10 μL、PI 5 μL，振荡混匀，避光孵育15 min。1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 细胞侵袭和迁移检测 ①细胞侵袭检测：用Matrigel 基质胶包被Transwell 小室上室，37 ℃静置1 h。收集各组转染12 h细胞，用不含血清的培养基重悬，制成密度5×104个/mL 的细胞悬液。取细胞悬液100 μL，加入Transwell 小室上室，下室加入完全培养液500 μL。然后将Transwell小室置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养24 h，取出Transwell 小室，轻轻拭去上室面未穿膜细胞，多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下拍照观察。随机选取5个200倍不重叠视野，计数穿膜细胞数。以穿膜细胞数代表细胞侵袭能力。②细胞迁移检测：Transwell小室无需包被Matrigel基质胶，其余步骤与细胞侵袭检测相同。

1.7 Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。收集各组转染12 h 细胞，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养24 h，收集细胞，加入RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，经BCA 法蛋白定量合格。加入5 × 蛋白上样缓冲液，100 ℃恒温水浴5 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白40 μg，SDS-PAGE 分离（恒压80 V，电流25 mA）。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH 一 抗，4 ℃孵育过夜。次日洗膜后，加入HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗，37 ℃孵育1 h。ECL 发光，暗室内显影、曝光，凝胶成像仪拍照，Image J 软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH 为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.8 靶向结合位点预测与验证 通过Circular RNA Interactome 在线软件预测circ_0006174 与antimiR-876-3p 的靶向结合位点。取传5 代、对数生长期A549 细胞，接种至6 孔板，每孔3 × 104个。然后将6 孔板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的的细胞培养箱培养。培养24 h，按LipofectamineTM2000 试剂盒说明，将MUT-circ_0006174、WT-circ_0006174 分别与miR-876-3p mimics 或miR-NC 共 转 染A549 细胞，转染12 h，收集细胞，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明检测荧光素酶活性。

1.9 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t 检验；两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组circ_0006174、miR-876-3p表达比较 si-circ_0006174 组circ_0006174 相 对 表 达 量 为0.30 ±0.04，si-NC 组 为1.00 ± 0.00，si-circ_0006174 组circ_0006174相对表达量低于si-NC组（t=52.500，P＜0.05）。si-circ_0006174 + anti-miR-876-3p 组miR-876-3p相对表达量为0.40±0.05，si-circ_0006174+anti-miR-NC 组 为1.00 ± 0.00，si-circ_0006174 +anti-miR-876-3p 组miR-876-3p 相对表达量低于si-circ_0006174+anti-miR-NC组（t=36.000，P＜0.05）。

2.2 下调circ_0006174、miR-876-3p表达对A549细胞增殖和凋亡的影响 si-circ_0006174 组细胞增殖抑制率和细胞凋亡率分别为（44.72 ± 2.01）%、（21.89±0.91）%，si-NC 组分别为（0.00±0.00）%、（6.67 ± 0.44）%，si-circ_0006174 组细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均高于si-NC 组（t 分别为66.746、45.173，P 均＜0.05）。si-circ_0006174 + anti-miR-876-3p 组细胞增殖抑制率和细胞凋亡率分别为（22.52 ± 1.55）% 、（11.60 ± 0.77）% ，si-circ_0006174 + anti-miR-NC 组分别为（44.44± 2.33）%、（21.90±1.26）%，si-circ_0006174+anti-miR-876-3p组细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均低于si-circ_0006174+anti-miR-NC 组（t 分别为23.499、21.294，P均＜0.05）。

2.3 下调circ_0006174、miR-876-3p表达对A549细胞侵袭和迁移的影响 si-circ_0006174 组细胞侵袭和迁移个数分别为（61.56±3.50）、（81.67±4.64）个，si-NC 组分别为（137.56 ± 7.69）、（172.78 ±9.99）个，si-circ_0006174 组细胞侵袭和迁移能力均低于si-NC 组（t 分别为26.985、24.814，P 均＜0.05）。si-circ_0006174+anti-miR-876-3p组细胞侵袭和迁移个数分别为（113.56 ± 5.44）、（150.56 ± 5.66）个，si-circ_0006174 + anti-miR-NC 组分别为（62.11 ±4.65）、（84.44±4.42）个，si-circ_0006174+anti-miR-876-3p组细胞侵袭和迁移能力均高于si-circ_0006174+anti-miR-NC组（t分别为21.568、27.621，P均＜0.05）。

2.4 下调circ_0006174、miR-876-3p表达对A549细胞Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表达的影响 见表1、2。

表1 下调circ_0006174表达对A549细胞Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响（±s）

表1 下调circ_0006174表达对A549细胞Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响（±s）

组别si-circ_0006174组si-NC组t P Bax 0.66±0.05 0.19±0.03 24.181＜0.05 Bcl-2 0.25±0.02 0.73±0.05 26.740＜0.05 E-cadherin 0.66±0.06 0.17±0.02 23.243＜0.05 N-cadherin 0.29±0.03 0.79±0.07 19.696＜0.05

表2 下调miR-876-3p表达对A549细胞Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响（±s）

表2 下调miR-876-3p表达对A549细胞Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响（±s）

组别si-circ_0006174+anti-miR-876-3p组si-circ_0006174+anti-miR-NC组t P Bax 0.29±0.03 0.67±0.05 19.551＜0.05 Bcl-2 0.55±0.05 0.27±0.03 14.406＜0.05 E-cadherin 0.29±0.03 0.68±0.05 20.065＜0.05 N-cadherin 0.62±0.06 0.30±0.04 13.313＜0.05

2.5 circ_0006174与miR-876-3p靶向调控关系 经Circular RNA Interactome 在线软件预测，circ_0006174 与miR-876-3p 存在靶向结合位点，见图1。共转染miR-876-3p mimics 与WT-circ_0006174、共转染miR-NC与WT-circ_0006174、共转染miR-NC与MUT-circ_0006174、共 转 染miR-876-3p mimics 与MUT-circ_0006174 的A549 细胞荧光素酶活性分别为0.28 ± 0.04、0.97 ± 0.05、0.99 ± 0.08、1.00 ±0.05。 共 转 染miR-876-3p mimics 与WT-circ_0006174 的A549 细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-NC 与WT-circ_0006174 的A549 细 胞（t=32.328，P＜0.05），共 转 染miR-NC 与MUT-circ_0006174、共 转 染miR-876-3p mimics 与MUT-circ_0006174 的A549 细胞荧光素酶活性比较差异无统计学意义（t=0.318，P＞0.05）。

3 讨论

circRNA 结构呈闭合环状，性质稳定，具有高度保守性和组织特异性。近年来随着研究的不断深入发现，circRNA具有“分子海绵”作用，能够吸附miRNA，使miRNA 无法与靶基因结合，进而参与调控靶基因的表达。因此，circRNA/miRNA/靶基因这一信号通路在多种肿瘤的发生、发展中具有重要作用［3-5］。既往研究显示，circ_UBR1 和circ_ERBB2 是肺癌细胞中表达上调的circRNA，分别通过靶向miR-545-5p/SSFA2、miR-7-5p/FOXM1 轴促进肺癌的发生和发展［6-7］；circ_0001073 和circ_0001320 则是在肺癌细胞中表达下调的circRNA，分别通过靶向miR-626/LIFR、miR-558/TNFAIP1/TPM1 轴抑制肺癌的发生和发展［8-9］。以上研究表明，不同circRNA 对肺癌发生、发展的影响不同。circ_0006174属于circRNA 家族成员之一。有研究报道，circ_0006174 在结直肠癌细胞中表达上调，其能充当miR-138-5p 的分子海绵上调MACC1 表达，进而促进结直肠癌的发生、发展，故敲减circ_0006174 可能对结直肠癌治疗具有积极作用［10］。细胞异常增殖和凋亡受阻是肺癌发生、发展的主要原因，故抑制细胞异常增殖并诱导其凋亡是其主要治疗策略。Bax 是细胞凋亡的促进分子，其表达增加能够促进细胞凋亡；Bcl-2作用与Bax相反，其表达增加能够抑制细胞凋亡［11］。本研究结果显示，敲减circ_0006174 能够抑制A549 细胞增殖并促进其凋亡，同时能够促进A549 细胞Bcl-2 蛋白表达、抑制Bax 蛋白表达。结果提示，circ_0006174可能通过调控Bax/Bcl-2影响肺癌细胞增殖和凋亡，故敲减circ_0006174可能起到治疗肺癌的作用。

细胞上皮间质转化是肿瘤细胞获得侵袭和迁移能力的重要途径，而抑制上皮间质转化过程则能阻碍肿瘤细胞的侵袭和迁移［12］。E-cadherin 和N-cadherin 是细胞上皮间质转化过程中的标志性分子，E-cadherin 表达升高而N-cadherin 表达降低提示细胞上皮间质转化过程受到抑制［13］。本研究结果显示，敲减circ_0006174 能够抑制A549 细胞的侵袭和迁移能力，同时能够抑制A549 细胞N-cadherin 蛋白表达、促进E-cadherin 蛋白表达。结果表明，敲减circ_0006174 可能通过抑制肺癌细胞上皮间质转化而抑制肺癌细胞的侵袭和迁移。

本研究经Circular RNA Interactome 在线软件预测和双荧光素酶报告基因实验验证，circ_0006174与miR-876-3p 存在靶向调控关系。miR-876-3p 基因定位于人9号染色体p21.1处，其异常表达与多种肿瘤的发生、发展及多药耐药密切相关。有研究报道，miR-876-3p 在卵巢癌细胞中表达下调，上调miR-876-3p 表达则能抑制卵巢癌细胞增殖和上皮间质转化，其机制与靶向抑制Wnt5a 表达有关［14］；miR-876-3p 在胰腺癌细胞中表达下调，过表达miR-876-3p 则可抑制胰腺癌细胞增殖并促进其凋亡，其机制与靶向抑制JAG2 表达有关，miR-876-3p/JAG2轴为胰腺癌治疗提供了新的靶点［15］；miR-876-3p 在胃癌细胞中表达下调，过表达miR-876-3p 能够通过靶向下调TMED3 降低胃癌细胞对顺铂的耐药性，miR-876-3p 可作为改善胃癌顺铂耐药的分子靶点［16］。本研究结果显示，下调miR-876-3p 能够逆转敲减circ_0006174 对A549 细胞恶性生物学行为的影响，提示circ_0006174 可能通过靶向负调控miR-876-3p 来影响肺癌细胞的恶性生物学行为。但circ_0006174 调控的miR-876-3p 靶基因还有待于进一步探究。

综上所述，敲减circ_0006174 可能通过靶向调控miR-876-3p抑制肺癌细胞恶性生物学行为。