整合素αV在应力刺激促心脏成纤维细胞活化中的作用机制研究*

程培培，丰明会，李 赞，2，陈誉文，吕 嵘，徐 明△

（1上海中医药大学基础医学院，上海 201203；2上海市第一人民医院嘉定分院，上海 201803）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）在全球的发病率和死亡率居高不下；心梗发生后，心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）在多种刺激因素下转分化为肌成纤维细胞（myofibroblasts，MFBs），分泌胶原，促进梗死区域的疤痕修复［1-2］。这一过程使心脏的硬度和均一性发生显著改变，血流动力学和结构的变化造成的应力改变成为CFs 直接而又持续的病理性机械力学刺激［3］。MI初期经化学性刺激转分化而来的MFBs 分泌大量胶原蛋白又将细胞外机械应力刺激不断传递至临近细胞中，促使更多CFs 转分化为MFBs；而MFBs 胞内的α-平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）主动收缩时能对抗这种应力刺激，又进一步加剧这种应力性正反馈调节作用［4］。然而，其中的作用机制仍待探索。

整合素家族（integrins）由α 和β 两个亚单位组成，是细胞与细胞外基质耦合的桥梁，也是机械能的转换器，将机械信息转化为生化信号［5］，通过激活黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）或TGF-β/Smad2/3 等信号通路影响细胞的增殖、迁移、存活等，被认为是传递细胞内外机械应力信息的关键作用分子，以往关于integrins 与心脏相关的众多研究也说明其重要作用［6-7］。然而已明确的24 种integrin 亚型分子在CFs中的作用尚缺乏系统性研究。本研究基于integrin αV 这个亚型展开，通过离体细胞学实验，以鼠尾I型胶原蛋白（collagen type I，Col I）基质模拟正常心脏组织的机械应力，以聚苯乙烯材料模拟病理状态下心脏组织的机械应力，结合细胞形态学、细胞行为学以及靶向基因干扰等手段，初步探索胞外应力刺激对CFs活化的直接影响，并探索其可能作用机制。

材料和方法

1 材料

1 周龄雄性C57BL/6 小鼠购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，许可证号为SCXK（沪）2017-0012；胎牛血清、高糖DMEM 培养液、双抗（青、链霉素）、D'Hanks 平衡液和0.25%trypsin 购自Gibco；兔抗integrin αV、Akt、FAK、p-Akt 和p-FAK 抗体购自Cell Signaling Technology；兔抗α-SMA 和Ki67 抗体购自Abcam；鼠抗GAPDH和Col I抗体及兔抗III型胶原蛋白（collagen type III，Col III）抗体购自Proteintech；3.17 g/L 的鼠尾Col I 基质购自BD；聚苯乙烯材质培养皿购自Corning；siRNA 和助转染试剂siRNA-Mate购自上海吉码制药有限公司；DAPI购自Sigma。

2 方法

2.1 原代CFs 分离培养 1 周龄雄性C57BL/6 小鼠处死后取心脏置于4 ℃PBS中洗净后置于1 mL无血清消化液中（含0.25% trypsin、1× HBSS 和1 mol/L HEPES），于4 ℃摇床16 h后取出，加入含血清裂解液（含15%胎牛血清、1× HBSS 和1 mol/L HEPES）充分吹打组织至完全消化后，使用200 目筛网过滤重悬于完全培养液（含10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM 培养液）中置于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中贴壁1 h 后更换新鲜培养液继续置于恒温培养箱中培养48 h 后换液，继续培养24 h，直至显微镜下观察细胞生长至85%～95%，可传代用于后续实验。

2.2 构建软、硬基质CFs 培养体系（1）使用聚苯乙烯材质的培养皿为硬基质，以1×108/L 的密度接种细胞悬液4.5 mL 于10 cm 培养皿中，再加入完全培养液3.5 mL；（2）鼠尾Col I 构建含细胞软基质（1 mL的体系：鼠尾胶200µL、NaOH 36µL、10×PBS 69µL和含6.95×104个细胞的完全培养液695µL），取6.5 mL 混匀铺于皿底，室温静置30 min 成胶后，加入完全培养液5 mL。上述两种体系细胞均置于恒温培养箱中培养。

2.3 软、硬基质CFs 培养体系传代 待到细胞长满至传代时，硬基质中细胞用0.25% tryspin 于37℃消化1 min，完全培养液终止消化，吸管反复吹打皿底直至显微镜下观察到细胞脱落后收集细胞悬液；软基质中细胞首先使用IV 型胶原酶液化鼠尾Col I，释放细胞，收集于离心管中，室温1 000 r/min离心5 min后弃上清，加入1 mL 完全培养液吹匀后，显微镜下计数并算出稀释倍数，补足完全培养液使得最终细胞悬液体系为每100µL 10 000个后用于实验。

2.4 siRNA 转染细胞敲减integrin αV 超净台中配制75 nmol/L 靶向integrin αV 的siRNA 和同浓度阴性对照（negative control，NC）siRNA，溶解于200 µL 无胎牛血清的高糖DMEM 培养液中，同时配制助转染试剂siRNA-Mate，室温混匀后，静置15 min 后加入60%细胞密度的第1 代CFs 中，转染8 h 后更换新鲜全细胞培养液继续培养48 h，收取细胞总蛋白进行Western blot验证其转染效率。

2.5 细胞形态观察 细胞培养至60%密度时，更换为含1%胎牛血清的细胞培养液同步化处理12 h，置于倒置显微镜10 倍物镜白场观察拍照，通过ImageJ软件计算其细胞面积和伪足分类数量，每次实验设置2个复孔，重复3次实验进行统计。

2.6 CCK-8 检测CFs 活力 取100µL 第1 代CFs 悬液等浓度接种于已构建好软硬基质的96 孔培养板中，无细胞等量培养液孔为空白对照组，每组样本均设复孔3 个，培养48 h 后，负压吸引器吸去上清液，每孔加入100 µL CCK-8 检测试剂于37 ℃恒温培养箱中培养1.5 h，然后用避光酶标仪于450 nm 处读取吸光度。实验重复3 次，使用GraphPad Prism 8 软件进行统计分析。

2.7 Ki67 免疫荧光染色检测CFs 的增殖能力 接种细胞或含细胞的鼠尾胶于3.5 cm 玻璃皿中，待细胞增殖至60%密度时，含1%胎牛血清的培养液同步化12 h 后，弃上清，加入500 µL 冰甲醇室温固定10 min 后，PBS 洗涤3 次，每次5 min；0.1%Trition X-100破膜，PBS 洗涤3 次，每次5 min；封闭液（5%牛血清白蛋白）封闭30 min 后，加入1∶100 兔抗Ki67，置于4 ℃摇床中过夜，PBS洗涤3次，每次5 min；Alexa Fluor 594荧光标记的羊抗兔Ⅱ抗（1∶250）室温避光孵育1 h 后，PBS 洗涤3 次，每次5 min；最后加入DAPI 室温避光孵育20 min，PBS 洗涤3 次，每次5 min；抗荧光淬灭剂封片后激光共聚焦显微镜采集图像并进行分析。

2.8 划痕实验检测CFs 的迁移能力 细胞于6 孔板中培养至85%密度，含1%胎牛血清的培养液同步化处理2 h后，使用10µL枪头做均一划痕，并在显微镜下拍照留取0 h原始图，继续培养36 h后再留取原始实验数据图，最终实验数据使用ImageJ 软件进行统计分析。

2.9 Western blot 检测CFs 中α-SMA、Col I 和Col III蛋白表达水平 收取实验组细胞，PBS 洗涤3 次，每孔加入65µL 细胞裂解液（1 mL 体系：940µL RIPA+20 µL PMSF+20 µL protein inhibitor+20 µL phosphatase inhibitor），冰上刮取细胞收集于1.5 mL 离心管中，裂解30 min 后于4 ℃、14 000 r/min 离心25 min，收取上清蛋白进行BCA 方法定量。100 ℃加热蛋白10 min 后使之变性，行蛋白电泳、转膜，5%牛血清白蛋白-TBST室温封闭1 h，稀释相关抗体于5%牛血清白蛋白-TBST 中（鼠抗GAPDH 为1∶5 000；鼠抗Col I为1∶1 000；兔抗Col III、α-SMA、integrin αV、FAK、p-FAK、Akt 及p-Akt 均为1∶1 000），4 ℃冰箱摇床中孵育过夜，TBST 洗膜3 次，每次5 min，室温孵育Ⅱ抗1 h，曝光显影采集图像信息后，使用ImageJ 软件进行数据统计分析。

2.10 免疫共沉淀检测蛋白相互作用 全收取蛋白裂解液浓度为2 g/mL，留取部分全蛋白裂解液做Input，剩余共计300 µg 加入1 g/L 的抗fibronectin 抗体2µL 或同比例稀释的同型IgG 抗体（阴性对照），4 ℃摇床过夜，加入含50%预洗脱的protein A/G 磁珠反复清洗后吸取上清，加入20 µL 5× loading buffer，100 ℃裂解变性10 min，Western blot验证。

3 统计学处理

使用GraphPad Prism 8 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示。使用非配对t检验进行两组间比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 软、硬基质培养CFs的形态变化

倒置荧光显微镜白场成像观察结果显示，soft组CFs形态较小，伪足呈丝状；与soft组相比，stiff组CFs形态显著增大，伪足呈板状（P＜0.01），见图1。

2 软、硬基质培养CFs增殖能力的差异

Ki67免疫荧光染色结果显示，与soft组相比，stiff组CFs 的Ki67 阳性率显著升高（P＜0.05），见图2A；CCK-8实验结果显示，与soft组相比，stiff组细胞活力显著增强（P＜0.01），见图2B。以上结果提示硬基质培养条件显著促进CFs增殖。

3 软、硬基质培养CFs 中胶原合成及其转分化标志物的改变

Western blot 结果显示，与soft 组相比，stiff 组细胞中α-SMA（肌成纤维细胞标志物）、Col I 和Col III蛋白表达显著增加（P＜0.01），见图3。这一结果提示硬基质培养条件下细胞中抗应力收缩性蛋白表达显著增加。

Figure 1.Morphological changes of cardiac fibroblasts（CFs）on soft and stiff matrix substrates.A：inverted microscopic bright-field cell image（×200）；B：statistics of filopodia and lamellipodia in the CFs（at least 10 cells in each view were measured）；C：statistics of size difference of the CFs（at least 10 cells in each view were measured）.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs soft group.图1 软、硬基质培养条件下CFs的形态变化

Figure 2.Varied proliferation ability of cardiac fibroblasts（CFs）on soft and stiff matrix substrates.A：Ki67 immunofluorescence staining and statistics（scale bar=100 µm）；B：CCK-8 statistical results.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs soft group.图2 软、硬基质培养条件下CFs的增殖能力的差异

Figure 3.Changes of collagen synthesis and transdifferentiation markers in the cardiac fibroblasts（CFs）on soft and stiff matrix substrates.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs soft group.图3 软、硬基质培养条件下CFs胶原合成及其转分化标志物的改变

4 软、硬基质培养CFs 中integrin αV/FAK/Akt 信号系统激活的差异

Western blot 结果显示，stiff 组和soft 组CFs 的integrin αV 蛋白表达量本底没有显著差异；但免疫共沉淀结果显示，stiff 组CFs 与细胞外基质中fibronectin 直接结合的integrin αV 大量出现（P＜0.05），表明软、硬基质培养条件下CFs的功能性integrin αV有差异，见图4A。与此同时，stiff组CFs的p-FAK 和p-Akt蛋白水平显著升高（P＜0.01），见图4B。这一结果提示硬基质培养条件下integrin αV 表达上调并伴有FAK/Akt信号的显著激活。

5 下调integrin αV 表达对硬基质培养CFs 伪足形态和迁移能力的影响

靶向integrin αV 的siRNA 转染CFs 下调integrin αV的表达，倒置荧光显微镜白场成像观察（图5A）及划痕实验（图5B）结果显示，与NC 组相比，siRNA 组CFs 板状/丝状伪足比例及细胞迁移能力均显著降低（P＜0.05）。

6 下调integrin αV 表达对硬基质培养CFs 胶原合成的影响

靶向integrin αV 的siRNA 转染CFs 下调integrin αV 的表达，Western blot 结果显示，与NC 组相比，siRNA 组CFs 中Col I 和Col III 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01），α-SMA蛋白表达量没有显著差异，见图6。这一结果提示integrin αV 参与硬基质CFs 细胞外基质胶原蛋白合成的直接调控。

7 下调integrin αV 表达对硬基质培养条件下CFs中FAK/Akt信号系统的同向抑制性效果

靶向integrin αV 的siRNA 转染CFs 下调integrin αV 的表达，Western blot 结果显示，与NC 组相比，siRNA 组CFs 中p-FAK 和p-Akt 蛋白水平显著降低（P＜0.01），见图7。这一结果提示integrin αV 可通过integrin αV/FAK/Akt 信号激活参与硬基质CFs 生物活性的调控。

讨 论

CFs 在心脏病变过程中的修复性纤维化和间质性纤维化中起重要作用，在此过程中，CFs 的激活受到多种物理和化学性因素的直接或间接作用，并分化为最活跃的纤维化效应细胞—肌成纤维细胞，从而发挥其细胞外基质重构和对抗机械应力的强大作用，以维持病变心脏的结构和功能的完整性［3，8］。本研究以软、硬基质为培养条件，模拟体内正常和病理状态下心肌组织的应力改变，并证实应力改变是CFs转分化为更为活跃MFBs亚型的关键性刺激因素，这一转分化激活过程依赖于integrin αV/FAK/Akt 信号轴的激活。同时，此研究具有一定局限性。由于正常心脏组织和梗死区病理组织微环境较复杂，尤其是细胞以及胶原蛋白组成比例的剧烈改变，是普通聚苯乙烯材质难以模拟的，后续研究可通过纳米制造技术或胶原仿生技术构建更为真实的模拟体内病理和生理环境的细胞体外培养环境来进行更为深入的探索［9］。

在正常心脏组织中，细胞组成和细胞外基质的精密结构使得其生物力学波动最小化地影响到心脏的形态和结构［10］。然而在病理性损伤（如心梗等）后的心脏中，除了心肌和血管的损伤外，细胞外基质中蛋白成分和比例的改变显著影响了机械力学传导特征，并且基质中大量交联的胶原蛋白更进一步增加组织刚度，这些变化导致更强更频繁的应力刺激不断作用于CFs，从而诱导其活化并转分化为MFBs，主导心肌纤维化进程［11］。以往的研究表明，正常心肌的杨氏模量为10 kPa，纤维化心脏达20～100 kPa，而体外培养CFs 的杨氏模量更高达GPa（1×106kPa）级别，商品化供应的鼠尾胶可经调整其胶原蛋白浓度制作为接近于生理状态刚性的培养体系［12-14］。因此，本研究探索这两种软、硬基质培养体系的比较观察实验，以明确不同刚度的培养环境对CFs 生物学行为的影响。与以往结果相似的是，硬基质培养的CFs表面积明显增大，伸出大量板状伪足，同时其增殖能力和胶原合成能力也大幅提升，并表达高量MFBs标志物α-SMA。这些结果充分证实相较于软基质中的静止性CFs，硬基质培养的CFs 发生了明显的转分化，成为高度活跃的MFBs，表明应力刺激是促进CFs活化的直接刺激因素。

Figure 4.Effects of soft and stiff matrix culture conditions on integrin αV/FAK/Akt signal pathway in cardiac fibroblasts（CFs）.A：integrin αV protein expression level；B：the levels of FAK，Akt and their phosphorylated proteins.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs soft group.图4 软、硬基质培养条件对CFs中integrin αV/FAK/Akt信号通路的影响

Figure 5.Down-regulation of integrin αV by siRNA transfection in cardiac fibroblasts（CFs）affected pseudopods and migration ability of CFs.A：the pseudopods of CFs were observed by inverted bright-field microscopy（×200）；B：original images and statistics of migration of CFs（×100）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs negative control（NC）group.图5 siRNA转染CFs下调integrin αV表达对CFs伪足和迁移能力的影响

Figure 6.Down-regulation of integrin αV by siRNA transfection in cardiac fibroblasts（CFs）affected secretion and transdifferentiation of CFs.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs negative control（NC）group.图6 siRNA转染CFs下调integrin αV表达对CFs分泌和转分化的影响

CFs 通过其胞膜上的感受器（如integrins、离子通道、G 蛋白偶联受体和生长激素受体等）感受其局部微环境的应力变化，并通过这些感受器下游的多种信号转导途径发生一系列应对性生物学行为改变，参与组织纤维化进程［15-16］。其中integrins 外接基质中的fibronectin 等蛋白结构，内连细胞内talin 和paxillin 等接头蛋白，从而将外界力学改变传导至肌动蛋白细胞骨架［17］，已知的24种integrin 分子中，CFs表 达α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α11β1/β3、αVβ1、αVβ3 和αVβ5 等亚型［6］。而在整体实验中的研究证实，integrin αV 与基质纤维化密切相关，并可能通过激活潜伏型TGF-β 的直接释放而发挥其生物学作用的［7，18］。鉴于integrins 的复杂性和多样性以及以往的研究基础，本研究主要集中于integrin αV 展开，我们的研究发现软、硬基质培养CFs的integrin αV本底表达量没有显著差异，但其功能性有显著差异，并通过结合于细胞外基质中的fibronectin 发挥其生物学作用，这一发现表明局部微环境中的刚性改变可能通过fibronectin-integrin αV 之间的分子联系进行由外向内的传递。

同时，integrins 所传导的机械信号除了直接作用于细胞骨架蛋白外，更可通过上述接头蛋白募集具有酪氨酸蛋白激酶活性的FAK 分子，并以此为基础产生级联性细胞内信号转导激活作用，使细胞发生一系列信号转导激活和转录激活，从而实现其诸如增殖、迁移、分泌等细胞行为学和功能学的巨大转变［5-7］。Akt以Akt1、Akt2和Akt3三种亚型存在，能够调节细胞黏附、转分化、诱导和凋亡等多种细胞因子功能，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶［19］。以往的研究表明FAK/Akt 信号通路在肿瘤中能够促进肿瘤细胞的增殖，迁移和侵袭［20-22］；同样在肝脏和肾脏纤维化中，该条通路也有相关研究［23-24］。然而其在心肌纤维化中的研究仍待探索。因此本研究进一步探索了硬基质培养条件下CFs 生物学行为的改变与integrin αV/FAK/Akt信号通路的关系，实验结果显示硬基质培养的CFs 中，伴随integrin αV 的上调表达，其下游FAK/Akt信号通路发生磷酸化激活，而通过siRNA 技术靶向下调integrin αV 则可显著抑制FAK/Akt 信号通路的激活，与此同时，细胞表现为板状伪足回缩，Col I和Col III 合成功能与迁移能力显著下降。这些结果表明integrin αV/FAK/Akt 信号通路在应力刺激CFs激活中的关键性作用。

综上所述，应力刺激是CFs 活化的关键性促进因素之一；这种应力刺激与integrin αV/FAK/Akt信号通路的激活直接相关；靶向integrin αV 分子的干预调节作用可显著抑制这种应力刺激介导的CFs 迁移和胶原分泌功能，从而降低其生物活性，因此针对integrin αV 分子的靶向性调节可为开发心肌纤维化相关心脏疾病的临床药物提供全新的策略方向。