酸枣叶总黄酮通过调控HIF-1α表达减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤*

赵焕新，杨 蓉，翟晓艳，杨李旺，季新燕，王惠洁

（山西中医药大学基础医学院，山西太原 030600）

心肌缺血后，尽早恢复血液再灌注是挽救缺血心肌的有效措施，但是大量研究证实，再灌注本身会造成心肌额外损伤，称为缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤［1］。在临床上，心肌I/R 损伤一般发生在心梗溶栓后，会进一步加重心肌细胞的损伤，是造成患者预后不良的严重因素。因此，如何减轻心肌I/R损伤一直是心血管领域研究的热点和难题。

有研究表明，钙超载、氧化应激和炎症反应等在心肌I/R 损伤中发挥重要作用，最终导致了心肌细胞凋亡或坏死，加重心肌损伤［2］。低氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是在氧平衡调节中起关键作用的转录因子，通过调控多种靶基因的转录活性来介导细胞对缺血和/或缺氧的适应性反应［3］。大量研究证实，HIF-1α可以通过减轻I/R造成的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等发挥心肌保护作用［4-7］。我们在前期研究中观察到，用DMOG 稳定HIF-1α 在心肌的表达后，I/R诱发的心肌损伤显著减轻［8-9］。

广泛分布于自然界植物中的多种黄酮类化合物对I/R 损伤的心肌具有显著的保护作用［10-12］。Ni等［13］观察到豆蔻明通过激活HIF-1α/VEGFA 途径可以减轻脑I/R 损伤。酸枣作为我国北方分布广泛的野生资源，其叶子的提取物主要化学成分是黄酮类物质，具有显著的抗自由基作用及体内抗氧化功能［14］。但是酸 枣叶总黄酮（total flavonoids fromZiziphus jujubavar.spinosaleaves，FZSL）对I/R 损伤的心肌是否具有作用尚不明确。因此，本研究通过建立心肌I/R 损伤大鼠模型，观察FZSL 对I/R 损伤心肌的影响，并探讨其机制。

材料和方法

1 动物

SPF 级健康雄性Wistar 大鼠60 只，6～8 周龄，体重（180～200）g，购自山西医科大学实验动物中心，动物许可证号为SCXK（晋）2017-0001。

2 主要试剂

FZSL 由山西中医药大学中药学院提供，并经过了中药鉴定教研室的鉴定（详细制备方法见参考文献［15］）。伊文思蓝（Evans blue）和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）购自Sigma；肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒，以及IL-1β、IL-6、TNF-α 和丙二 醛（molondialdehyde，MDA）ELISA 检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；caspase-3 活性检测试剂盒购自BIOMOL；HIF-1α 抑制剂Lificiguat（YC-1）购自Cayman；HIF-1α和GAPDH兔多克隆抗体购自Santa Cruz。

3 实验方法

3.1 实验分组 60 只雄性大鼠随机分为6 组（每组10 只，其中5 只动物用于缺血面积和心梗面积测定，另外5 只用于心肌组织MDA 含量、SOD 活性和caspase-3 活性测定，以及Western blot 检测）：假手术（sham）组，冠状动脉左前降支下只穿线不结扎，穿线30 min后腹腔注射生理盐水；I/R组，心肌缺血30 min后，腹腔注射生理盐水，再灌注3 h；低、中、高剂量FZSL 组（FZSL-L、FZSL-M 和FZSL-H 组），心肌缺血30 min 后，50 mg/kg、100 mg/kg 和200 mg/kg 的FZSL腹腔注射，再灌注3 h；YC-1组，术前30 min腹腔注射HIF-1α 抑制剂YC-1（20 mg/kg），心肌缺血30 min，后200 mg/kg的FZSL腹腔注射，再灌注3 h。

3.2 大鼠心肌I/R 模型的建立 参照本实验室常规方法［8-9］，结扎大鼠冠状动脉左前降支造成左心室缺血，以心电图出现ST 段和（或）T 波抬高或降低等心肌缺血波形为结扎成功标准，结扎30 min（即缺血30 min）后，松开结扎线恢复冠脉血液灌注并持续（即再灌注）3 h。

3.3 心肌梗死面积的测定 于再灌注结束后原位重新结扎冠脉左前降支，经股静脉注入2%伊文思蓝染料，待大鼠口唇变蓝后取出心脏，将左心室沿垂直于心腔纵轴方向自心底向心尖平均切成六片环形的薄片，置于1%TTC 中，37 ℃避光孵育15 min，然后用10%甲醛溶液固定。正常心肌被伊文思蓝染成蓝色，缺血心肌染为红色，梗死的心肌为白色。对心脏切面进行扫描，并利用Image-Pro Plus 图像分析软件分别测定蓝色、红色和白色区域的面积。缺血面积（%）=缺血区总面积（area at risk，AAR）/左心室面积（left ventricle，LV）×100%；心梗面积（%）=梗死区面积（area of necrosis，An）/AAR×100%

3.4 血清LDH 和CK 活性及IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量测定 再灌注3 h结束后经腹主动脉取血，室温静置30 min，1 509×g离心15 min，取血清，按照检测试剂盒测定LDH 和CK 活性，按照ELISA 试剂盒测定IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

3.5 心肌组织MDA 含量及SOD 活性测定 各组动物于再灌注结束后取缺血区心肌组织30 mg，提取蛋白后按照检测试剂盒操作说明进行测定。

3.6 心肌组织caspase-3 相对活性测定 再灌注结束后取缺血区心肌组织30 mg，充分裂解后离心取50µL 上清与底物于37 ℃孵育1.5 h，酶标仪检测其吸光度（A）。用蛋白含量标准化校正A值，以sham组的活性为1，计算其余各组的相对活性。

3.7 Western blot 法检测心肌组织HIF-1α 的蛋白表达水平 再灌注结束后取缺血区心肌组织约50 mg，提取总蛋白，用BCA法测定总蛋白浓度，按照本实验室常规方法进行操作［8-9］。用Image-Pro Plus 图像分析软件进行灰度分析，以GAPDH作为内参照。

4 统计学处理

采用SPSS 20.0 软件进行统计学处理。计量实验数据采用均数±标准差（mean±SD）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 FZSL对大鼠心肌梗死面积的影响

以AAR/LV 的百分率作为判别心肌缺血程度的指标，各模型大鼠之间无显著差异，表明在进行I/R实验过程中，结扎冠状动脉左前降支的手术操作在各组动物间无差异性，各组动物模型的心肌缺血程度大致相同，排除了由操作（如结扎范围、结扎深度等）造成的误差，因而在此模型基础上的实验结果具有可比性，见图1A、B。与sham 组相比，I/R 导致大鼠心肌发生梗死（P＜0.01）；给予FZSL 治疗后，中剂量和高剂量组心肌梗死面积均显著缩小（P＜0.05），而低剂量组梗死面积与模型组相比无显著差异（P＞0.05），见图1A、C。

2 FZSL对大鼠血清LDH和CK活性的影响

血清LDH和CK活性常用于反映心肌损伤程度。与sham 组相比，I/R 组大鼠血清LDH 和CK 活性均显著增加（P＜0.01）；中、高剂量FZSL组血清LDH和CK活性与I/R 组相比均显著降低（P＜0.01），而低剂量FZSL组则无显著变化（P＞0.05），见图2。

3 FZSL对大鼠血清炎症因子水平的影响

在sham 组中，大鼠血清IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平均较低，发生心肌I/R 损伤后，这些炎症因子均显著增加（P＜0.01）；中、高剂量FZSL组其含量比I/R 组显著降低（P＜0.01），但低剂量FZSL 组变化与I/R 组比较无显著差异（P＞0.05），见图3。

4 FZSL 对大鼠心肌组织MDA 含量及SOD 活性的影响

I/R 使大鼠心肌组织中MDA 含量显著增加，SOD活性显著降低（P＜0.01）；在再灌注前给予FZSL 后，中、高剂量组大鼠心肌MDA 含量下降而SOD 活性显著升高（P＜0.01），低剂量组二者的变化与I/R组比较均无显著差异（P＞0.05），见图4。

5 FZSL对大鼠心肌细胞凋亡的影响

与sham 组相比，I/R 大鼠心肌缺血区caspase-3相对活性显著升高（P＜0.01）；给予中、高剂量FZSL后，caspase-3相对活性显著降低（P＜0.01），而低剂量组变化与I/R组比较无显著差异（P＞0.05），见图5。

6 FZSL 对大鼠I/R 心肌组织HIF-1α 蛋白表达的影响

用Western blot 方法检测心肌组织中HIF-1α 的蛋白表达水平，结果显示，与sham组比较，I/R增加了心肌组织HIF-1α 的蛋白表达量（P＜0.01）；而中、高剂量FZSL 可以使心肌组织HIF-1α 的蛋白水平进一步增加（P＜0.05），低剂量组HIF-1α 的蛋白水平变化与I/R组比较无显著差异（P＞0.05），见图6。

7 抑制HIF-1α后FZSL对大鼠I/R损伤心肌的影响

应用YC-1 抑制HIF-1α 后，200 mg/kg FZSL 对大鼠I/R 损伤心肌的保护作用显著减弱，与FZSL-H 组比较，心肌梗死面积显著增大（P＜0.01，图1C），血清LDH 和CK 活性显著增加（P＜0.01，图2），血清炎症因子含量显著增加（P＜0.01，图3），心肌组织MDA含量增加而SOD 活性显著降低（P＜0.01，图4），caspase-3活性显著增加（P＜0.01，图5）。

讨 论

Figure 1.Myocardial ischemic area and infarct size in the rats.A：representative images of Evans blue and TTC staining；B：myocardial ischemic area；C：myocardial infarct size.AAR：area at risk；LV：left ventricle；An：area of necrosis.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs I/R group；△△P＜0.01 vs FZSL-H group.图1 大鼠心肌缺血面积与梗死面积

Figure 2.The activity of serum LDH and CK in the rats.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs I/R group；△△P＜0.01 vs FZSL-H group.图2 大鼠血清LDH与CK活性

本实验通过建立大鼠心肌I/R 模型，研究FZSL对I/R 损伤心肌的作用。研究结果显示，FZSL 显著减轻了I/R 造成的大鼠心肌损伤，使心梗面积显著缩小，血清LDH 及CK 活性降低，IL-1β、IL-6 和TNF-α含量减少，心肌组织MDA 含量和caspase-3 活性降低，SOD 活性增加。同时，本研究也观察到FZSL 上调了I/R 心肌组织HIF-1α 的蛋白表达水平，这一结果提示FZSL 对I/R 损伤心肌的保护作用可能与HIF-1α有关。

缺氧在缺血引起的病理生理变化过程中起着关键作用。HIF-1 是在氧平衡调节中起关键作用的转录因子，可以通过调节多种靶基因的转录来介导细胞对缺血和/或缺氧的适应性反应。HIF-1 由一个α亚基和一个β亚基构成，其中α亚基被认为是体内低氧调控的主要功能亚基和活性亚基。有研究表明，HIF-1α表达增加是心肌缺血时最早期的分子水平上的适应性反应［16］。上调HIF-1α 表达可以抑制I/R 所致的大鼠心肌炎症反应［17］，减轻糖尿病大鼠I/R 心肌的氧化应激损伤［18］。我们在研究中也观察到，缺血后处理通过上调HIF-1α 表达，减轻了高脂血症大鼠缺血再灌注造成的心肌梗死和细胞凋亡［9］，表明HIF-1α具有明确的心肌保护作用。

从植物中提取的黄酮类化合物具有改善心脑血管循环、清除自由基、抗氧化等功效。有研究显示，酸枣叶的提取物总黄酮在小鼠体内可以发挥抗氧化和抗衰老的作用［14］。本研究在大鼠模型上观察到，心肌缺血后在再灌注前给予FZSL，可以显著减轻I/R造成的心肌梗死和细胞凋亡，减少心肌炎症反应和氧化应激，提示FZSL 对I/R 损伤的大鼠心肌具有保护作用。研究结果还显示，FZSL 在减轻心肌损伤的同时，上调了大鼠心肌组织HIF-1α 的蛋白表达量，这一结果初步提示，HIF-1α可能介导了FZSL的心肌保护作用。为了进一步明确HIF-1α 在FZSL 保护大鼠心肌中的作用，我们应用YC-1 抑制HIF-1α 后，观察到FZSL 减小大鼠心梗面积、减轻炎症反应和细胞凋亡、增强抗氧化能力的作用显著减弱，这一结果证实HIF-1α 在FZSL 的保护机制中确实发挥了一定的作用。

Figure 3.The levels of serum IL-1β，IL-6 and TNF-α in the rats.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs I/R group；△△P＜0.01 vs FZSL-H group.图3 大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平

Figure 4.The content of MDA and the activity of SOD in the myocardial tissue of rats.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs I/R group；△△P＜0.01 vs FZSL-H group.图4 大鼠心肌组织MDA含量及SOD活性

Figure 5.The activity of caspase-3 in the myocardial tissue of rats.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs I/R group；△△P＜0.01 vs FZSL-H group.图5 大鼠心肌组织caspase-3活性

Figure 6.The protein level of HIF-1α in the myocardial tissue.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs I/R group.图6 大鼠心肌组织HIF-1α蛋白水平

综上所述，本实验对大鼠进行心肌I/R 的研究结果提示，FZSL 减轻大鼠I/R 心肌损伤可能与其上调HIF-1α 表达有关，但是其确切机制尚需我们在后续的研究中进一步探讨。