5种外源物质对干旱胁迫下笔筒树幼苗生长的缓解效应

刘 鑫，付丽娟，于 静，郑钠元，刘保东，丁国华*

(1 哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院, 哈尔滨 150025; 2 中国人民大学 附属中学丰台学校, 北京 100074)

随着全球气候变化的加剧，极端气象事件的频繁发生和降雨格局的变化加剧了区域尺度的干旱程度，导致世界范围内大面积森林死亡，这对全球造成了严重的影响[1-2]。干旱对植物的伤害主要表现为光合下降、生长减慢、膜透性增加、细胞内容物外渗和失水萎蔫，产生这些伤害的主要原因是活性氧的增加所造成的氧化伤害。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等是细胞抵御活性氧伤害的酶保护系统，逆境胁迫下的植物主要通过提高抗氧化酶活性清除体内多余的活性氧，降低膜脂过氧化作用，增强植物对逆境胁迫的抵抗能力。

桫椤科(Cyatheaceae)植物起源于南美洲或澳大利亚的晚侏罗纪，是现存唯一的树状蕨类植物，其中笔筒树(Sphaeropterislepifera)分布于中国广东及福建的山坳中[10]。笔筒树在生长发育过程中对环境要求苛刻，喜阴湿，忌强光。近年来，蕨类植物以其别具一格的观赏性越来越受到人们的喜爱，但目前野生蕨类植物资源已受到严重破坏，引种驯化已成为一种既能满足人们的观赏需求又能进一步保护种质资源的途径。干旱是引种驯化工作中需要解决的常见问题。如何提高笔筒树的抗旱性成为影响其能否在含水量较低地区进一步推广的重要因素。为此，提升笔筒树抗旱性和外界环境适应性已成为当前研究重点内容。目前，应用外源物质提高蕨类抗旱性的研究鲜见报道。本研究以笔筒树为材料，测定外源SA、MT、PP333、Ca和EBR对干旱胁迫下笔筒树幼苗的生长和生理特性的影响，为探究外源物质对干旱胁迫下笔筒树幼苗的缓解效应和生理机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

笔筒树[Sphaeropterislepifera(Hook.) R. M. Tryon]孢子于2020年采自华南植物园，在4 ℃下保存；培养所用土壤取自黑龙江省尚志市帽儿山，土壤类型为暗棕壤；水杨酸购自哈尔滨化工化学试剂厂；氯化钙购自黑龙江省阿城化学试剂厂；褪黑素、多效唑和2，4-表油菜素内酯均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 试验设计

参照檀龙颜等[11]的方法，将参试土壤过10目筛网后置于蒸汽高压灭菌锅中灭菌以除去蕨类及苔藓孢子，灭菌条件为131 ℃、40 min，得到实验用土。将所有实验用土充分混匀，在电热温箱中烘干至恒重。取28个方形带盖1 L的培养盒，每盒加入300 g上述干土和160 mL蒸馏水(含水量约为35%)。按刘保东等[12]方法播种笔筒树孢子。播种后每4 d喷施1次蒸馏水，保证土壤含水量在33%～37%，当笔筒树生长至孢子体时期，将28盒材料平均分为7组，分别进行如下处理。CK为非干旱对照组，继续每4 d喷施1次蒸馏水，使土壤含水量保持在 33%～37%；DCK为自然干旱对照组，不进行喷施处理；DCK+SA、DCK+MT、DCK+PP333、DCK+Ca和DCK+EBR为外源物质处理组，是在自然干旱的同时分别喷施1.0 mmol/L SA、150 μmol/L MT、100 mg/L PP333、2.5 mmol/L CaCl2和0.3 mg/L EBR溶液，外源物质最适浓度通过预实验的结果获得。

喷施处理时将不同溶液装入压力喷壶，在幼苗上方5 cm处匀速喷雾，叶片表面均匀附着一层溶液即可。处理时间与CK组相同，即每4 d喷施1次，共喷施4次，每个处理3次重复，每个重复8～10株幼苗。每次喷施处理后的次日上午取样，设第1次喷施处理为第0天，则4次取样的时间分别为第1、5、9和13天；在每处理组中随机选取6株幼苗，测定生长量、光合特性指标和相对电导率；在其余的幼苗中剪取生长状况基本一致的充分展开叶，用液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱中，用于其他指标的测定。取样和测定生理指标时各处理均进行3次重复。

试验期间每隔4 d取样测定1次各处理土壤含水量(表1)，用公式(N-M)/N计算。式中：N表示烘干前土壤质量(g)，M表示电热温箱烘干后土壤质量(g)。由表1可知CK的土壤含水量保持在34%～37%，DCK、DCK+SA、DCK+MT、DCK+PP333、DCK+Ca和DCK+EBR的含水量均逐渐降低，处于干旱胁迫状态。材料培养条件设置为：光照25 ℃/14 h，黑暗25 ℃/10 h，相对湿度为50%。

表1 试验期间各处理土壤含水量Table 1 Soil moisture of each treatment during the test

1.3 测定指标及方法

用游标卡尺测定第1 天和第13 天植株地上部分和地下部分的长度，差值即为生长量，进一步得到生长率，生长率(%)=(第13天长度-第1 天长度)/第1 天长度×100%[13]；在第1、5、9和13天采集叶片样品，用Li-6400便携式光合作用测定仪测定叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)，用双波长法测定新鲜叶片的叶绿素含量(Chl)，浸提液为95%乙醇[14]。

同时，第1、5、9和13天叶片样品的可溶性糖(SS)含量测定采用蒽酮比色法[15]，脯氨酸(Pro)含量测定采用磺基水杨酸法[16]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[17]，相对电导率(EL)采用电导率仪测定[18]；超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用氮蓝四唑法[18]，过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚显色法[16]，过氧化氢酶(CAT)活性采用过氧化氢法[19]。

1.4 试验数据处理

采用Excel 2013软件处理数据，采用SPSS Statistics 20软件对数据进行显著性检验和相关性分析。将整理后的数据，用模糊数学隶属度公式进行定量转换，再将各指标隶属函数值取平均值进行相互比较。隶属函数公式为：

U(Xi)=(Xi-Xmax)/(Xmax-Xmin)

式中U(Xi)为隶属函数值，Xi为某项指标测定值，Xmax和Xmin为所有处理中某一指标的最大值和最小值[20]。

2 结果与分析

2.1 外源物质对干旱胁迫下笔筒树幼苗生长的影响

在自然干旱胁迫第13天时，观察各处理笔筒树幼苗表型(图1)可知，与CK处理相比，DCK处理幼苗有较多的叶片出现黄化，底层叶片边缘枯萎；与DCK处理相比，DCK+SA处理幼苗的叶片明显复绿，生长状态与CK接近；DCK+MT、DCK+Ca和DCK+PP333处理幼苗的个别叶片出现黄化，但是黄化程度都轻于DCK处理。

同时，对各处理笔筒树幼苗生长指标的测定结果(表2)显示，干旱胁迫显著抑制笔筒树幼苗地上部分的生长，DCK处理幼苗地上部分的生长量比CK显著降低了20.00%，其生长率较CK降低1.78%；各外源物质处理组幼苗地上部分的生长量均显著高于DCK处理，其中的DCK+SA和DCK+EBR处理又显著高于其余处理，其生长量恢复至CK水平，生长率明显高于CK。同时，干旱胁迫显著促进地下部分的生长，DCK处理幼苗地下部分的生长量比CK显著增加了10.64%，其生长率较CK增加了0.87%；各外源物质处理幼苗生长量和生长率均不同程度地高于DCK处理，其中的DCK+SA和DCK+EBR处理均较高，生长量增幅均达到显著水平，生长率分别较DCK提高2.26%和2.31%。可见，外源物质SA、MT、PP333、Ca和EBR对干旱胁迫下笔筒树幼苗地上和地下部分的生长都有一定促进作用，并以SA和EBR处理的促进效果更佳。

表2 不同处理下笔筒树幼苗生长的变化Table 2 Variation of the growth of S. lepifera seedlings under different treatments

2.2 外源物质对干旱胁迫下笔筒树幼苗光合特性的影响

图2显示，在干旱胁迫(DCK)条件下，笔筒树幼苗叶片的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和叶绿素含量在各时期均比CK不同程度降低，且除第1天外降幅均达到显著水平，各指标在第13天时分别下降到CK的55.12%、72.41%、66.01%和34.72%(P<0.05)。从第5天开始，各外源物质处理幼苗叶片的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和叶绿素含量均不同程度地高于同期DCK处理，且干旱胁迫时间越长增幅越大，在干旱胁迫第9和13天增幅均达到显著水平，并多以DCK+SA、DCK+MT和DCK+EBR处理的表现更突出。其中，在处理第13天时，与DCK处理相比，笔筒树幼苗叶片的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和叶绿素含量分别增加15.93%～39.82%、4.79%～25.40%、1.40%～24.25%和18.37%～34.93%。可见，各类外源物质均能有效缓解干旱胁迫对笔筒树幼苗叶片光合作用的抑制，并以适宜浓度的SA和MT处理的缓解效果更好。

2.3 外源物质对干旱胁迫下笔筒树幼苗细胞膜伤害的影响

各时期干旱胁迫(DCK)笔筒树幼苗叶片的相对电导率和MDA含量均比同期CK不同程度增加，且除了第1天外差异均达到显著水平(P<0.05)，在第13天时分别较CK显著增加了64.12%和26.10%(图3)。各外源物质处理(DCK+SA、DCK+MT、DCK+PP333、DCK+Ca和DCK+EBR)幼苗叶片的相对电导率和MDA含量均比同期DCK处理不同程度降低，相对电导率在第9天、MDA含量在第5天开始降幅均达到显著水平；在干旱胁迫第13天时，各处理叶片相对电导率和MDA含量比DCK处理分别显著下降13.17%～21.85%(图3，Ⅰ)和11.99%～24.29%(图3，Ⅱ)，并均以DCK+SA和DCK+EBR处理明显较低，显著低于其余处理。结果表明，外源物质处理能够显著降低干旱胁迫下笔筒树幼苗叶片的相对电导率和MDA含量，并以SA和EBR处理对植物细胞膜伤害的缓解效果较好。

2.4 外源物质对干旱胁迫下笔筒树幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

从图4可知，随着干旱胁迫时间的延长，干旱胁迫和各外源物质处理笔筒树幼苗的SOD和POD活性均呈现先上升后下降的趋势，并均在第5天达到最大值，而它们的CAT活性均逐渐下降。在干旱胁迫第1天，DCK和各外源物质处理幼苗叶片SOD、POD和CAT活性均与CK无显著差异。在胁迫第5～13天，DCK处理幼苗叶片的SOD、POD和CAT活性在各时期大多比CK显著降低；各外源物质处理SOD、POD和CAT活性在各时期大多比DCK处理不同程度升高，且胁迫时间越长差异越明显，并以DCK+SA、DCK+MT处理的酶活性明显较高；在胁迫第13天时，DCK处理叶片的SOD、POD和CAT活性分别为同期CK的74.94%、87.64%和84.16%，差异达到显著水平(P<0.05)；各外源物质处理SOD、POD和CAT活性与DCK处理相比分别增加5.18%～18.79%、0.43%～9.33%、1.92%～7.84%，并均以DCK+SA和DCK+MT和DCK+EBR处理增幅较大，均达到显著水平。由此可知，随着干旱胁迫的加剧，笔筒树幼苗叶片抗氧化酶活性下降，外源物质处理可以有效缓解抗氧化酶活性降低，增强其抗旱性，并以喷施SA、MT和EBR的增强效果较好。

2.5 外源物质对干旱胁迫下笔筒树幼苗渗透调节作用影响

由图5可知，在干旱胁迫(DCK)下，笔筒树幼苗叶片脯氨酸和可溶性糖含量在干旱胁迫处理第5～13天均比CK显著增加，在第13天时增幅分别达到100%和28.08%(P<0.05)；干旱胁迫条件下，各外施外源物质处理叶片的脯氨酸含量也均显著高于同期CK，但与同期的DCK处理均无显著性差异；与DCK处理相比较，各外源物质处理叶片的可溶性糖含量在第5天无显著变化，在第9～13天大多显著降低，且以DCK+SA和DCK+MT处理相对较低；在胁迫处理第13天时，各外源物质处理叶片可溶性糖含量分别较DCK处理显著降低了12.39%、11.99%、5.48%、8.02%和11.76%(P<0.05)，而其脯氨酸含量降低幅度不显著。以上结果表明，各外源物质均能显著降低干旱胁迫下笔筒树幼苗叶片可溶性糖含量，有效缓解其积累，并以EBR处理效果最好，但5种外源物质对脯氨酸积累都没有显著影响。

2.6 外源物质对笔筒树幼苗干旱胁迫伤害缓解作用的综合评价

根据单一指标评价外源物质对干旱胁迫下笔筒树幼苗伤害的缓解效应，难以真实准确地反映缓解效果。本研究通过隶属函数法将每个指标值转换为(0, 1)的纯数，优化了不同指标之间的可比性，对不同处理下的幼苗13个相关生理指标进行综合分析，最后根据各处理平均隶属度值的由大到小进行排序，位次越靠前，处理的缓解效果越好。结果(表3)表明，5种外源物质对笔筒树干旱胁迫的缓解效果表现为：SA>MT>EBR>Ca>PP333，这与各处理幼苗叶片的表型观察结果相似。

表3 各外源物质处理下指标的隶属函数值Table 3 Membership function value of indicators under the treatment of various exogenous substances

3 讨 论

干旱胁迫是对植物生长产生负面影响的主要威胁之一，可能导致ROS积累与抗氧化防御系统之间的失衡，造成氧化损伤。干旱胁迫还会抑制植物的生长发育，处于生殖生长阶段的植物对干旱胁迫高度敏感。

本研究的结果表明，干旱胁迫显著抑制笔筒树地上部分生长，促进地下部分生长，证明当土壤水分条件发生变化时，笔筒树幼苗会发生形态的变化来适应干旱环境。随着干旱胁迫时间的延长，笔筒树幼苗的地上部分生长量减少，地下部分生长量增加，可能是由于干旱胁迫抑制了植物的细胞分裂，生物量分配倾向于地下部分，导致植株地上部分矮小、生长缓慢[21]。植物生长通常具有“旱长根、水长苗”的特性，蕨类植物笔筒树幼小的孢子体的生长也遵循这一规律。研究表明，EBR在调节植物细胞形态和生长发育进程中发挥重要作用。通过对一种BR合成缺陷突变体cpd(constitutive photomorphogenic dwarf)的研究中证明，BR 在植物生长中所起到的作用，揭示了 BRs 在有丝分裂调控中的作用[22]。本研究结果表明，干旱胁迫下喷施5种外源物质对笔筒树幼苗的生长具有促进作用。也表明干旱胁迫下经SA、MT、CaCl2和EBR处理的植株株高和根长均较未处理对照显著增加[23-26]。

同时，本研究中干旱胁迫下笔筒树幼苗生长量的下降可能是由于ROS的过量产生，导致膜稳定性降低和MDA含量升高[27]，加剧脂质、蛋白质和叶绿素的损伤，并最终减少植物生物量积累。本研究中外源施用SA、MT、PP333、CaCl2和EBR可以提高笔筒树幼苗的抗旱性，这可能与提高了笔筒树叶片光合作用效率和叶绿素含量、增强了叶片的气体交换属性、促进了抗氧化酶活性、降低了相对电导率和MDA含量有关。此前，有一些研究报道了干旱对许多植物生长都具有破坏性影响，破坏的范围因胁迫的严重程度和植物生长阶段而不同。也有研究表明SA、MT、PP333、CaCl2和EBR在干旱胁迫下对不同植物的生长性状有重要的改善作用。

植物在遭受干旱胁迫时，为了减少水分损失和细胞内CO2浓度而减少气孔开度，造成光合作用中的气孔限制。同时，光合系统接收的过多光能由于无法正常耗散而造成细胞的受损，细胞中累积 ROS 转而造成叶绿素的消解并攻击光合作用机构，造成不可逆的伤害，从而导致光合作用效率总体下降。本研究发现，随着土壤水分含量降低，笔筒树幼苗叶片的Pn、Gs、Tr和叶绿素含量出现下降的趋势，说明干旱胁迫下Pn和Gs的下降，严重影响水分利用和气体交换。叶面喷施SA、MT、PP333、CaCl2和EBR均缓解了这些指标的下降趋势。Habibi等[28]研究表明，干旱胁迫大麦植株叶片的Pn、Gs和Tr显著降低，而喷施SA处理能显著提高这些参数。其他研究结果也表明，适当施用MT、PP333、CaCl2和EBR能显著抑制干旱条件下植物叶片Pn、Gs、Tr和叶绿素含量降低的幅度，对叶片光合作用有积极的缓解作用[24, 29-31]。

另外，植物还通过调节生理代谢抵御或缓解干旱胁迫造成的伤害，这些自发的调节体现着植物本身的耐旱性。脯氨酸和可溶性糖是干旱胁迫下植物渗透调节过程中非常重要的物质。本研究结果表明，干旱胁迫下笔筒树幼苗叶片中的脯氨酸和可溶性糖含量显著增加，增强了自身适应逆境的能力，与王雨婷等[32]在葡萄上的研究结果一致。经过SA、MT、PP333、CaCl2和EBR处理的笔筒树幼苗叶片的可溶性糖含量增加较缓，可能与这些物质在干旱前期减轻了植株受损强度等因素有关，与前人的研究结果一致[40-41]。而本研究中5种外源物质对笔筒树幼苗叶片脯氨酸含量无显著影响，可能是由于脯氨酸在蕨类植物的渗透调节过程中不起主要作用，或脯氨酸的合成和降解只与笔筒树水分状况有关。

4 结 论

干旱胁迫限制了笔筒树幼苗的正常生长。外施SA、MT、PP333、Ca和EBR对干旱胁迫下幼苗生长的缓解作用是多个生理活动相互作用的结果，本研究对13个相关生理指标进行了相关性和隶属函数分析，根据综合得分位次得出，SA对干旱胁迫下笔筒树幼苗生长的缓解效果最好，其后依次为MT、EBR、Ca和PP333。这些外源物质可以减缓笔筒树幼苗光合系统遭受的破坏，维持幼苗正常生长；通过调节抗氧化酶活性，减轻膜脂过氧化损伤，降低MDA含量和相对电导率，保护细胞膜结构的稳定性，在一定程度上提高了笔筒树的抗旱能力。

刘鑫是本研究的实验设计者和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；于静，郑钠元协助实验进行；付丽娟，刘保东参与实验设计；丁国华是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。