干旱及复水条件下接种AMF和根瘤菌对疏叶骆驼刺根系生长的影响

高文礼，陈晓楠，伊力努尔·艾力，马晓东

(1 新疆师范大学 生命科学学院， 乌鲁木齐 830054；2 新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，乌鲁木齐 830054)

随着塔里木河生态输水工程的持续进行，下游地区干旱的生态环境得到有效的改善，区域内的优势物种疏叶骆驼刺(Alhagisparsifolia)已经由原来的斑块性生长过渡成为沿河道及漫溢区的片状生长[1]，为防风固沙，涵养水源起到了关键作用[2-3]。塔里木河的生态输水分春秋两季，在干旱的夏季来临之前，下游地区的疏叶骆驼刺种子在春季得到充分的水分萌发生长成幼苗；夏季持续的高温天气，土壤中水分蒸发严重，植物受到干旱胁迫；秋季塔里木河再次的输水使得经过一个夏季干旱胁迫的疏叶骆驼刺再次得到的水分灌溉，此过程中下游地区疏叶骆驼刺逐渐适应了从正常水分-干旱胁迫-复水的生长过程[4]。

疏叶骆驼刺为豆科植物，根瘤菌可侵染其根部形成互惠共生的根瘤，同时疏叶骆驼刺还是丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)的寄主植物，侵染频度和侵染强度分别达65%和90%[5]，所以疏叶骆驼刺可同时被根瘤菌和丛枝菌根真菌侵染，形成根瘤菌—疏叶骆驼刺—AMF的三重共生体[6-7]。随着塔里木河下游生态输水的持续进行，区域内疏叶骆驼刺的生长要经历输水期内充足水分到夏季干旱胁迫再到下次输水期时复水的过程，三重共生体之间的适应性也随之发生变化。

根系是植物最先感知土壤中水分变化的部位，根系构型的变化不仅受到遗传因素的影响，也受到土壤环境的影响[8-9]。近年来关于丛枝菌根真菌与根瘤菌混合接种的研究多集中在农业生态系统中[10-11]，而在荒漠生态系统这样水源匮乏地区的研究鲜有报道。因此，本研究在塔里木河间歇性生态输水的背景下，探讨疏叶骆驼刺根系在水分、AMF和根瘤菌共同作用下的生长规律，旨在为塔里木河下游荒漠河岸林的保育恢复提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

供试植物疏叶骆驼刺种子和供试沙土均采集于塔里木河下游尉犁县，供试沙土的沙和土以体积比1∶1的比例混合，其田间持水量为22.75%，平均全磷含量为0.69 g·kg-1，有效磷含量17.2 mg·kg-1，全钾含量22 g·kg-1，全氮含量0.64 g·kg-1，有效氮含量13.2 mg·kg-1，pH约7.7。沙土过2 mm筛去除杂质后在110 ℃、0.14 MPa下连续湿热灭菌1 h备用，供试丛枝菌根真菌采用体积比为1∶1幼套近明球囊霉(Glomusetunicatum)和摩西斗管囊霉(Glomusmosseae)的混合菌种，来源于新疆农业科学院微生物研究所，菌剂孢子密度25个·mL-1；根瘤菌为天山中间根瘤菌(Mesorhizobiumtianshanense)，购于中国微生物菌种库。

1.2 试验方法

试验设置4种接菌方式，即单接种丛枝菌根真菌(AMF)、单接种根瘤菌(R)、双接种丛枝菌根真菌+根瘤菌(AMF+R)和不接种对照(CK)；同时设置3组干旱胁迫处理，即土壤相对含水量70%±5%(D0)、土壤相对含水量20%±5%(D1)和干旱胁迫60 d后复水至正常水分(D2)。共计组成12个接种干旱处理组合，每个处理设置3次重复，每重复1盆，每盆种5株植物。

选取颗粒饱满、大小基本一致的疏叶骆驼刺种子用10% H2O2浸泡10 min进行消毒处理，再用无菌水反复冲洗3次，然后分别播种于装有4 kg供试沙土的实验花盆中，待幼苗出土10 d后间苗，每个花盆中留大小一致的幼苗5株进行室内控制实验，65 d后收获并测量相关指标，收样采用挖掘法。接种AMF的方法为距土壤表层10 cm处均匀接种40 g AMF菌剂(菌剂为白三叶草扩繁所得，包含孢子和菌丝的土壤混合物，孢子密度为35个/g)，对照组加入等量的灭活菌土；接种根瘤菌的方法为将根瘤菌剂在YMA培养基上25 ℃活化培养3 d，然后转入盛有1 000 mL YMA培养液的三角瓶中震荡培养30 h后，配成根瘤菌悬液(104CFU/mL)，每盆接种100 mL，对照组添加100 mL的蒸馏水。控制实验前，先用WET水分测定仪分别测出正常水分及干旱胁迫时的土壤相对含水量，然后将各花盆进行称重处理，此时重量作为各处理的标准重量；控制试验期间，每天对各花盆进行称重并补水至标准重量，以保持水分的恒定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 共生体生长指标(1)AMF侵染率：室内控制实验结束后收获疏叶骆驼刺，将根系洗净后剪成1-2 cm，进行固定、碱解离、酸化、染色的步骤。具体如下：①固定：按70%乙醇：6 mol·L-1乙酸= 6∶1的比例配置成固定液，将剪好的根段放入固定液中固定12 h。②碱解离：用蒸馏水冲洗掉固定液，加入1 mol·L-1KOH溶液，没过根系，解离15 min。③酸化：用蒸馏水冲洗掉碱液，加入0.1 mol·L-1HCl溶液，没过根系，3～5 min后，蒸馏水洗去酸液。④染色：将水洗后的根样置于试管中，加入0.25 g Trypan+250 mL甘油+250 mL乳酸配制而成的染色液，没过样品，室温下染色1 h。水洗1遍后，将样品放入塑料小瓶中，加入等量甘油和乳酸混合的贮存液，没过样品，室温下放置，于光学显微镜下观察。将染好色的根样平辅在载玻片上，轻轻盖上盖玻片，制成装片，先用4×物镜观察，发现可疑现象(类似菌丝、泡囊的物质或黑色阴影)后，再用10×物镜观察。观察根系内是否有菌丝、丛枝和泡囊等典型菌根结构。根据网格交叉法，先统计AMF侵染根段数，将染色后的根系置于直径9 cm带有网格的培养皿中，40倍镜下观察根系与网格交叉部位是否有菌根结构[12-13]。依据统计结果计算AMF侵染率(AMF侵染率/%=侵染根段数/全部根段数×100%)。(2)根瘤数量：采用挖掘法将疏叶骆驼刺根系取出，小心用蒸馏水清洗去除根系附着的沙土，清洗过程用滤网过滤，然后在解剖镜下进行根瘤形态学观察，并记录每株的根瘤数目。

1.3.2 骆驼刺根系生长及抗氧化酶活性(1)根系生长指标：用EPSON扫描仪，采用洗根法拍摄根系照片，应用Win-Rhizo软件分析根系的总根长、根表面、根体积、根平均直径、根系分叉数、根尖数指标。(2)根系SOD、POD活性：SOD测定用NBT还原法，POD采用愈创木酚法进行测量。SOD、POD试剂盒均购于北京索莱宝科技有限公司。

1.4 数据统计分析

差异显著性分析用SPSS21.0软件，用Duncan法在0.05水平进行多重比较，Excel和PhotoshopCS6作图，数据均为3个重复的平均数±标准误。

2 结果与分析

2.1 水分及接种处理对疏叶骆驼刺根系AMF侵染率和根瘤数目的影响

2.1.1 根系AMF侵染率如图1、2所示，在不同干旱胁迫及接种处理下，单接种根瘤菌(R)和不接种对照(CK)的疏叶骆驼刺根系均未发现泡囊和丛枝等典型的丛枝菌根真菌结构，而单接种丛枝菌根真菌处理(AMF)和双接种处理(AMF+R)的疏叶骆驼刺根系发现大量泡囊、根外菌丝和丛枝等结构，且侵染率较高，说明土壤、种子灭菌效果以及AMF接种效果良好，符合预期。单接种R和不接种对照CK的疏叶骆驼刺根系AMF侵染率均为0；单接种AMF和双接种(AMF+R)处理的疏叶骆驼刺根系AMF侵染率都较高，但干旱胁迫(D1)会导致AMF侵染率显著降低，而复水(D2)对AMF的侵染率无补偿作用。在正常水分(D0)条件下，双接种AMF+R处理的疏叶骆驼刺AMF侵染率比单接种AMF处理提高9.20%，但未达到显著水平(P>0.05)；在干旱胁迫(D1)及复水(D2)条件下，双接种AMF+R处理的疏叶骆驼刺AMF侵染率反而显著低于单接种AMF处理(P<0.05)，降幅分别为48.93%和41.13%。

2.1.2 根瘤数目疏叶骆驼刺根系在单接种AMF处理和不接种对照CK中均未发现根瘤，而在单接种R和双接种AMF+R处理中均有根瘤的生长，说明土壤、种子灭菌处理以及根瘤菌的接种效果良好，与预期结果一致。各处理疏叶骆驼刺根瘤形态观察结果(图3)显示，在正常水分(D0)处理下根瘤饱满(图3，A、D)；在遭遇干旱胁迫时，根瘤形态萎蔫，且颜色加深(图3，B、E)；在干旱复水后，双接种处理的根瘤恢复至饱满状态(图3，F)，而单接种R处理的根瘤仍为颜色加深的萎蔫状态(图3，C)。同时，各处理的根瘤数量的观测结果(图4)表明，在正常水分(D0)到干旱胁迫(D1)再到复水(D2)的过程中，单接种R处理的疏叶骆驼刺根瘤数量逐渐降低， D1和D2时的根瘤数量分别比D0时降低9.91%、39.93%，且D2与D0差异达到显著水平(P<0.05)；双接种处理的疏叶骆驼刺根瘤数量则先降后升，在D1时比D0显著降低， D2又比D1显著增加，并恢复至D0水平。另外，双接种处理的疏叶骆驼刺根瘤数量在D0和D1条件下与单接种R无显著差异(P>0.05)，在D2条件下比单接种R显著提高116.50%(P<0.05)。

2.2 水分及接种处理对疏叶骆驼刺根系生长的影响

2.2.1 根系吸收范围根长、根表面积和根体积是衡量植物根系在土壤中分布范围的重要指标。首先，在正常水分(D0)条件下，单接种AMF和双接种处理疏叶骆驼刺的根长分别比对照组CK显著提高45.64%、51.44%，而单接种R无显著变化；在干旱胁迫(D1)和复水处理(D2)条件下，3组接种处理中均仅双接种处理根长显著高于对照组，增幅分别为19.70%和25.40%，其余接种处理均与对照无显著差异(图5，Ⅰ)。其次，疏叶骆驼刺的根表面积在正常水分(D0)条件下仅双接种处理比对照组显著提高41.74%，在干旱胁迫(D1)条件下仅单接种R处理比对照组显著提高25.40%，在复水(D2)条件下双接种和单接种AMF处理分别比对照组CK显著提高20.40%和7.50%(P<0.05)，而各水分条件下其余接种处理的根系表面积与对照均无显著性差异(图5，Ⅱ)。另外，疏叶骆驼刺根体积在正常水分(D0)条件下3组接种处理(单接种AMF、单接种R、双接种AMF+R)分别显著高于对照组76.92%、46.15%、120.51%，在复水(D2)条件下分别比对照显著提高66.85%、50.54%、82.07%，在干旱胁迫(D1)条件下仅单接种AMF显著高于对照70.56%，单接种R和双接种处理与对照均无显著性差异(P>0.05)(图5，Ⅲ)。

2.2.2 根系吸收能力根系直径、分叉数、根尖数等是衡量根系吸收功能的重要指标。首先，各接种处理(单接种AMF、单接种R和双接种AMF+R)的疏叶骆驼刺根系平均直径在正常水分(D0)条件下分别比对照组CK显著提高47.31%、44.51%、110.40%(P<0.05)；在干旱胁迫(D1)条件下，仅单接种AMF处理的根系平均直径比对照组CK显著提高84.79%，而单接种R处理和双接种处理虽稍高于对照组，但均未达到显著水平(P>0.05)；在复水处理(D2)之后，3组接种处理的根系直径分别比对照组CK显著提高94.73%、103.61%、115.36%(图6，Ⅰ)。说明单接种AMF在各种水分条件下均能显著促进疏叶骆驼刺根系直径增加，而单接种R和双接种仅在正常水分和复水条件下有显著促进效应；复水对于接种处理的疏叶骆驼刺根系直径具有一定的补偿效应。

其次，3组接种处理疏叶骆驼刺根尖数量在正常水分(D0)条件下比对照组CK稍高，但无显著性差异(P>0.05)；在干旱胁迫(D1)及复水条件(D2)下仅单接种AMF和双接种处理比对照显著提高，增幅在D1条件下分别为55.13%、65.78%，在D2条件下分别为21.18%、37.06%(P<0.05)，而单接种R处理的根尖数与对照组无显著性差异(图6，Ⅱ)。由此可知，单接种AMF和双接种处理均可在干旱胁迫及复水处理后显著提高疏叶骆驼刺的根尖数。

再次，3组接种处理的疏叶骆驼刺根系分叉数在正常水分(D0)和干旱胁迫(D1)条件下均表现为双接种>单接种AMF>单接种R>对照组CK，且前两者均与对照存在显著性差异；在复水(D2)后，仅双接种处理的疏叶骆驼刺根系分叉数显著高于对照组，其他两组单接种处理均与对照组无显著性差异(P>0.05)(图6，Ⅲ)。说明双接种处理在各种水分条件下均对疏叶骆驼刺根系分叉数显著促进作用，而单接种AMF处理仅在正常水分和干旱胁迫下有显著促进作用，且复水仅对于双接种处理的疏叶骆驼刺根系直径具有显著的补偿效应。

2.3 水分及接种处理对疏叶骆驼刺根系根系抗氧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶(SOD)是植物清除体内自由基的第一道防线，过氧化物酶(POD)可以清除由SOD催化产生的过氧化氢，减轻对植物的毒害作用，它们是检测植物对胁迫响应的良好生理指标。其中，3组接种处理(单接种AMF、单接种R、双接种AMF+R)的疏叶骆驼刺根系的SOD活性在各种水分条件下均比相应对照显著提高，增幅在D0时分别为80.10%、92.48%、127.92%，在D1时分别为80.24%、66.74%、94.52%，在D2时分别为66.77%、50.16%、91.43%，并双接种处理均不同程度地高于两组单接种处理，两组单接种处理之间SOD活性无显著性的差异(图7，Ⅰ)。

其次，由正常水分(D0)到干旱胁迫(D1)再到复水处理(D2)的过程中，4组接种处理的疏叶骆驼刺根系POD活性均呈逐渐上升趋势，但变化均不显著(P>0.05)；在正常水分(D0)和旱后复水处理(D2)条件下，单接种AMF和双接种处理疏叶骆驼刺根系POD活性均比对照组显著提高(P<0.05)，增幅在D0时分别为86.71%和94.59%，在D2时分别为88.40%和118.47%，但单接种R处理与相应对照组之间差异均不显著(P>0.05)；在干旱胁迫(D1)条件下，3组接种处理(单接种AMF、单接种R、双接种)根系的POD活性分别比对照组显著提高了103.17%、20.90%、22.91%，但仍以单接种AMF和双接种增幅更高(图7，Ⅱ)。由此可见，在3组水分条件下，双接种和单接种AMF处理疏叶骆驼刺POD活性均比单接种根瘤菌和对照显著提高，而双接种表现更优，而根瘤菌仅在干旱胁迫时对POD活性有显著促进作用。

3 讨 论

近年来研究发现，当植物同时接种AMF和根瘤菌时，二者表现出协同促进的作用，一方面根瘤菌可以促使植物根系类黄酮的排出，有利于丛枝菌根真菌孢子的萌发及丛枝结构的生长[14]，从而提高AMF的侵染率；另一方面AMF的存在可以为根瘤的生长提供磷营养，保持氮磷比的平衡，同时AMF还可以促进结瘤基因(Nod)的表达[15]，从而促进根瘤的生长。本研究也发现，在正常水分条件下，双接种处理疏叶骆驼刺根系的AMF侵染率及根瘤数量要优于单接种处理，与前人研究结果一致，但在遭遇干旱胁迫时，双接种处理疏叶骆驼刺的根系AMF侵染率和根瘤数反而低于单接种处理。初步分析，水分条件的改变是AMF和根瘤菌协同作用变化的主要原因。

当疏叶骆驼刺遭遇干旱胁迫时，整体生长受到抑制，从而导致地下生物量的减少[16]，进而影响到共生体系统的碳投入。AMF和根瘤菌共同寄生在根系，同时二者都需要从寄主植物体内得到碳源，生态位重叠，当植物受到胁迫导致生长受到抑制时，AMF和根瘤菌原来的协同促进关系减弱，甚至转为竞争关系，从而导致AMF侵染率的降低和根瘤数量的减少[17-18]。本研究中复水之后单接种AMF、双接种处理的疏叶骆驼刺的根系AMF侵染率仍然与干旱胁迫时无显著差异，表明复水对疏叶骆驼刺的AMF侵染率无补偿效应；同时，双接种处理疏叶骆驼刺的根瘤数量在复水后显著增加，而单接种R处理的根瘤数量反而降低，初步认为双接种处理的疏叶骆驼刺的根瘤由于AMF的存在，对水分变化更加敏感，且AMF可促进根系水分的吸收，进而影响根瘤体内水分的变化，故复水后土壤水分条件得到改善，双接种处理的根瘤生长表现出明显的补偿效应；这一点在根瘤形态化上也得以体现，复水后双接种处理的根瘤表现出饱满状态，而单接种R处理的根瘤仍然为颜色加深的萎蔫状态。

根系是植物养分和水分吸收的关键器官，其生长状况对整株植物的生长发育起着至关重要的作用，在遭遇干旱胁迫时，植物通过改变根系形态及生理等方面的变化来维持自身生长，以便应对干旱胁迫带来的负面效应[19-20]。其中根长、根表面积和根体积是衡量根系在土壤中吸收范围的重要指标[21]，而根系直径、分叉数、根尖数等是衡量根系吸收能力的重要指标[22-23]。本研究结果表明，双接种处理显著提高了疏叶骆驼刺根系的吸收范围和吸收能力，且比单接种更有优势，但干旱胁迫会导致双接种的促生优势降低[24]，研究还发现复水后双接种疏叶骆驼刺的根系能更早地对水分变化作出响应，从而实现复水后的迅速生长。塔里木河输水工程分春秋两季，秋季输水后，下游地区的疏叶骆驼刺幼苗处于复水状态，双接种处理可以使其在过冬之前快速生长，增强自身抗逆性，因此双接种处理对于疏叶骆驼刺幼苗在间歇性生态输水生境中的初期定植、生存具有极其重要意义。

超氧化物歧化酶(SOD)是细胞内清除氧自由基的第一道防线，可以清除体内氧自由基的毒害，而过氧化物酶(POD)可以和SOD催化产生的H2O2反应，分解成为水，从而消除H2O2对细胞的毒害，所以可以通过对SOD、POD活性的变化来反映植物在逆境胁迫中的生长状况[25-26]。有研究表明，在植物遭遇干旱胁迫时，细胞内会催生大量的活性氧，对细胞产生毒害，植物通过提高体内抗氧化系统的清洁能力来清除过多的氧自由基，从而减轻活性氧对自身的毒害[27]。通过本实验也发现，干旱胁迫导致了疏叶骆驼刺根系SOD、POD活性的升高，并且双接种的疏叶骆驼刺根系SOD、POD活性在干旱胁迫时最高，说明双接种使疏叶骆驼刺在干旱胁迫时仍具有较高的抗逆性，从而更好地避免干旱胁迫所带来的损伤，而且复水之后仍保持较高的抗氧化酶活性，这与前人研究结果一致[28-29]。本研究还发现，疏叶骆驼刺根系SOD活性更容易受到接菌的影响，对接种方式(单接种AMF或单接种R或双接种AMF+R)的响应没有显著差异，而POD活性在单接种R处理时无明显的增加，在单接种AMF和双接种时才表现出显著的提高，并且AMF和根瘤菌同时存在时，POD活性要高于单接种AMF处理。初步分析，AMF的存在是诱导促进SOD活性提高的主要原因，根瘤菌的存在可增强AMF提高POD活性的作用[30]，因此在增强疏叶骆驼刺抗逆性方面而言，双接种更具优势。

综上所述，在正常水分条件下，双接种AMF+根瘤菌均能显著扩大根系吸收范围(根长、根表面积、根体积)，增强根系吸收能力(根直径、根系分叉数)，提高抗氧化酶(SOD、POD)活性，且优于两组单接种处理；在遭遇干旱胁迫条件下，双接种AMF+根瘤菌处理对疏叶骆驼刺根系生长的促生作用降低，仅根长、POD活性显著高于单接种处理，根尖数、根系分叉数、SOD活性与单接种无显著差异，而根表面积、根体积、根直径反而低于单接种AMF处理；在旱后复水条件下，双接种AMF+根瘤菌处理的疏叶骆驼刺在根系吸收范围、吸收能力以及抗氧化酶活性方面均表现出积极的补偿作用，优于单接种处理，但是各生长指标仍低于正常水分条件，表明双接种AMF+根瘤菌处理对疏叶骆驼刺的生长虽然有一定的补偿作用，但仍抵消不了干旱胁迫对植物生长带来的抑制作用。