近红外光驱动的纳米光敏剂UCNPs@SiO2@TiO2@MnO2的制备与性能*

曹潇楠， 胡静慧， 张敏丽， 王 浩， 靳丹丹，朱良亮， 陈文雪， 宫培军

(浙江师范大学 先进催化材料教育部重点实验室，浙江 金华 321004)

当前，癌症已经成为高发病率、低治愈率的全球性重大疫病，精准用药和针对性治疗是提高癌症治愈率和减轻患者病痛的必由之路.作为一种非入侵性治疗技术，光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是借助光敏剂在激发光下产生的活性氧物种(reactive oxygen species，ROS)氧化损伤生物大分子或细胞器以诱导癌细胞的凋亡和坏死.相比手术、放疗和化疗等传统疗法，PDT具有作用范围精准、安全性高、见效快、适应性好等优势[1-2].然而，卟啉衍生物等临床有机光敏剂存在激发光的穿透能力差、化学稳定性低等缺点，导致PDT目前多用于浅表性癌症的治疗.

TiO2的生物相容性好、毒性低，化学稳定性显著优于有机光敏剂，具有持久产生ROS的能力，可以将无机光敏剂单独或与其他材料复合后使用[3-4].上转换纳米粒子(upconversion nanoparticles，UCNPs)具有独特的上转换发光性能，作为能量转换器与光敏剂构建成纳米光敏剂可用于深组织下肿瘤治疗[5-6].当这类纳米光敏剂富集于肿瘤时，利用可以穿透深组织的近红外(NIR)光激发UCNPs发射紫外光和可见光，借助这些发射光激活与UCNPs复合的光敏剂产生ROS，从而杀灭深组织下的癌细胞[7-9].研究表明，由TiO2与UCNPs构成的纳米光敏剂在NIR光下表现出良好的抗肿瘤性能[10-11].然而，很多实体瘤在生长过程中会出现与正常组织不同的性质，包括弱酸性环境、溶氧量偏低、H2O2浓度偏高等，而PDT极大依赖氧气浓度，肿瘤乏氧将会极大制约PDT效果，导致治疗不彻底、肿瘤耐药或转移等后果[12].近年来，利用MnO2在酸性环境下催化H2O2分解产生O2和H2O的能力，研究人员设计响应肿瘤微环境的MnO2基纳米药物，通过催化分解内源性H2O2提高癌细胞的溶氧量和ROS产生能力，增强PDT在肿瘤治疗中的效果.同时，MnO2与H2O2的反应产物Mn2+具有磁共振成像增强功能，为监测药物在肿瘤部位的富集和治疗进程提供影像学手段[13-15].因此，如果将MnO2，UCNPs和TiO23种功能材料复合，有望获得可以借助肿瘤微环境特征改善肿瘤的溶氧量并增强PDT活力的纳米光敏剂[16].然而，MnO2在紫外和可见光区具有较宽的光学吸收带，可能与TiO2竞争性吸收UCNPs的上转换发光，导致光敏剂的ROS产能下降.因此，合理的结构设计和组分配比不仅是提高纳米光敏剂ROS产能的关键，也能确保药物具有体内应用所必需的均匀形貌和尺寸分布.

考虑到核-壳结构的NaYF4:Yb,Tm@NaGdF4:Yb@SiO2@TiO2纳米复合粒子(UST)在NIR光照射下可以产生多种ROS[17-18]，本研究首先采用吸附法对UST修饰聚乙烯亚胺(PEI)，随后利用PEI与KMnO4的反应沉积MnO2，制备了可以通过催化分解H2O2产氧增强ROS产能的NIR光驱动纳米光敏剂NaYF4:Yb,Tm@NaGdF4:Yb@SiO2@TiO2-PEI@MnO2(USTM).PEI使KMnO4的还原反应发生在UST粒子表面，生成的负电性MnO2在正电性PEI的静电引力下原位沉积在UST表面，通过控制MnO2的沉积量可以获得形貌和尺寸均匀的纳米光敏剂，也确保TiO2优先于MnO2吸收UCNPs的上转换发光.在表征USTM的形貌、物相和元素构成的基础上，研究了MnO2沉积量对USTM的光学性质、Zeta电位、粒径分布、催化分解H2O2产氧，以及产生ROS的性能的影响，并借助自由基捕获实验鉴定ROS的类型，分析USTM作为一种潜在的纳米光敏剂用于乏氧肿瘤治疗的可能性.

1 实验部分

1.1 试 剂

高锰酸钾(AR)，北方天医化学试剂公司；支化型聚乙烯亚胺(PEI，99%)，Alfa Aesar化学有限公司；罗丹明B(RhB)、1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF，97%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；过氧化氢(质量分数≥30%，水溶液)、二水合乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、叔丁醇、对苯醌(98%)、乙醇及其他试剂，国药集团化学试剂有限公司.

1.2 光敏剂USTM的制备

核-壳结构纳米复合粒子NaYF4:Yb,Tm@NaGdF4:Yb@SiO2@TiO2(UST)的制备方法参考文献[18].将10 mg UST超声分散在5 mL 2 mg/mL PEI溶液中，搅拌2 h后离心，用水洗去过量的PEI，得到PEI修饰的UST(简写为UST/PEI)，将粒子分散在5 mL水中，加入227 μL质量浓度为1 mg/mL的KMnO4溶液，搅拌反应30 min后超声30 min，离心并洗涤固体2次，得到纳米光敏剂NaYF4:Yb,Tm@NaGdF4:Yb@SiO2@TiO2-PEI@MnO2，记为USTM-1(MnO2的理论质量分数为1.25%).调整KMnO4溶液的体积为455，910，1 820 μL，采用相同方法分别得到MnO2的理论负载量分别为2.5%，5%，10%的USTM，分别记为USTM-2，USTM-3和USTM-4.

1.3 USTM催化分解H2O2产氧的能力

将5 mg USTM分散在15 mL 10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.5)中，搅拌均匀，用溶解氧测定仪测定溶液的初始溶氧量.在搅拌下快速注入H2O2溶液使体系中H2O2的浓度为1 mmol/L，在搅拌下记录溶液的溶氧量.改变体系中H2O2的浓度至0.1和0.5 mmol/L，测定对应体系的溶氧量变化.

1.4 USTM产生ROS的测定

单线态氧(1O2)产生能力检测：将2.5 mg 样品分散在2.5 mL 水中，加入2.5 mL质量浓度为30 mg/L的DPBF的乙醇溶液，避光吸附1 h后用2.1 W/cm2的980 nm近红外光照射反应液，间隔15 min取样，离心去除粒子，测试上清液的UV-Vis谱，以DPBF的降解效果评估光敏剂产生1O2的能力.对于添加H2O2的反应，体系中H2O2的浓度为1 mmol/L，其余条件不变.

1.5 样品的表征

分别采用D8 Advance型粉末X-射线衍射仪(XRD，德国Bruker公司)、JEM-2010型透射电子显微镜(TEM，日本JOEL公司)和配套能谱仪(EDS)测定样品的物相结构、形貌和元素构成；借助ESCALAB 250Xi型X射线光电子能谱(XPS，美国Thermo Fisher Scientific公司)分析样品中Mn，N等元素的氧化态和化学环境；用盐酸溶解光敏剂并稀释溶液，借助GGX-810型原子吸收分光光度计(北京海光仪器公司)测定样品中的Mn元素含量；将样品分散在水中，采用Zetasizer nano ZS90型纳米粒度和Zeta电位分析仪(英国Malvern公司)测定水力学粒径分布(DLS)和Zeta电位；以P4PC型紫外-可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)测定样品吸收光谱(UV-Vis)；以MDL-H-980-3W型980 nm近红外激光器(长春新产业光电技术有限公司)为激发光源，使用F-7000型荧光光谱仪(日本Hitachi公司)测定上转换发射光谱；使用JPB-607A型溶解氧测定仪(上海仪电科学仪器公司)测定溶液中的溶氧量.

2 结果与讨论

2.1 USTM的表征

图1为样品的TEM图.UCNPs为近似六棱柱状粒子，在包裹SiO2和TiO2后得到的UST粒子呈现球形且表面相对平整，UST的核-壳结构性质已被相关研究证实[19].随着KMnO4用量从227 μL增加至910 μL，USTM的表面出现小尺寸片状沉积物且表面粗糙度增大，USTM的平均粒径由85 nm增大至90 nm，表明尽管MnO2的负载量呈现逐渐增大的趋势，但其质量分数并不大.当KMnO4用量达到1 820 μL时，USTM-4的粒径和MnO2包裹层厚度均明显增大，样品中出现由MnO2纳米片组成的聚集体，意味着生成的MnO2超出了UST表面的可承载能力，导致USTM-4的形貌不均匀.借助原子吸收光谱测定了USTM中Mn元素的含量，计算得出上述4个样品中MnO2的实际负载量分别为0.1%，2.4%，4.4%和11.0%.USTM-3的EDS谱出现F，O，Na，Yb，Gd,Tm，Y，Si，Ti和Mn等元素信号峰，与目标光敏剂的元素构成一致，证实USTM的成功制备.

a:UCNPs;b:UST;c:USTM-1;d:USTM-2;e:USTM-3;f:USTM-4

图2为USTM的XRD图.图中出现六方相NaYF4(JCPDS NO.16-0334)和锐钛矿相TiO2(JCPDS NO.21-1272)的特征衍射峰，未观察到MnO2的典型衍射信号，说明MnO2为无定形结构，与文献制备的纳米MnO2的物相一致[20].此外，图中无其他杂质的衍射峰，表明MnO2的负载不会改变UCNPs和TiO2的物相结构.

图2 USTM的XRD图

a:全谱图;b:USTM-3的Mn 2p;c:UST/PEI的N 1s;d:USTM-3的N 1s

2.2 USTM的光学性质

图4a为光敏剂的UV-Vis谱.USTM在300～700 nm出现MnO2的宽吸收峰，对应于MnO6八面体的配体场中Mn(Ⅳ)的3d电子从低能态轨道(t2g)向高能量(eg)轨道的d-d跃迁能带[24].吸收峰的增强表明光敏剂中MnO2负载量的增大.图4b为光敏剂在980 nm激发光下的上转换发射光谱，USTM在345，362，452和476 nm处发射峰的位置与UST的发射谱一致，分别对应于UCNPs中Tm3+的1I6→3F4，1D2→3H6，1D2→3F4和1G4→3H6跃迁[18].随着MnO2负载量的增大，USTM的发光显著减弱，其中MnO2对紫外区发射光的衰减作用较强，这是由于紫外发射峰与MnO2的强吸收区的重叠程度较高，发生了由UCNPs到MnO2的荧光共振能量转移[17,25].

a:UV-Vis谱;b:上转换发射光谱

2.3 USTM的Zeta电位与水力学粒径

图5a为样品的Zeta电位值.PEI改性使UST的Zeta电位由-2.5 mV增大至38.4 mV，UST/PEI表面的强正电性为负电性MnO2的沉积提供了静电引力.随着MnO2沉积量的增大，USTM的Zeta电位从27.3 mV逐渐降至7.9 mV.较高的Zeta电位使粒子之间的静电排斥力较强，有助于USTM在溶液中稳定分散.上述样品的平均水力学粒径(MHD)与多分散系数(PDI)见图5b.UST/PEI的MHD为220 nm，PDI为0.081，均略小于UST的对应数值，表明PEI的强正电性使UST/PEI的分散效果优于UST.

a:Zeta电位;b:平均水力学粒径与多分散系数

当MnO2负载量不超过4.4%时，USTM的MHD随MnO2负载量的增加仅轻微增大，这是由于DLS测定的MHD值包含胶体的直径和双电层厚度，UST/PEI表面的PEI链在溶液中倾向于舒展，导致双电层厚度增大；随着MnO2在UST/PEI表面沉积量的加大，USTM的直径则逐渐增加，PEI链的舒展受到限制、双电层厚度减小，两方面因素的共同作用使MHD值增长缓慢.较大Zeta电位值使USTM-1，USTM-2和USTM-3的PDI值均很小(0.065～0.125).过多MnO2的生成使USTM-4的直径进一步增大，减小的Zeta电位不利于粒子的稳定分散，导致USTM-4的MHD突跃到389 nm.较大的MHD和不均匀的形貌决定了USTM-4难以作为可靠的光敏剂用于光动力治疗.

2.4 USTM催化产氧的性能

考虑到含有H2O2的弱酸性缓冲液被广泛作为模拟肿瘤细胞的生理介质用以研究纳米MnO2的催化产氧能力[13,16]，本文在磷酸盐缓冲液(pH=6.5)中测试了USTM催化H2O2产氧的能力.溶液的溶氧量在加入USTM后快速上升，图6a显示溶氧量的增幅与USTM中MnO2的负载量呈正相关，而UST对H2O2几乎不分解，图6b证实溶液中溶氧量的增幅随H2O2浓度的增加而增大，说明USTM-3具有催化H2O2分解产生O2的能力.由于MnO2纳米粒可以催化肿瘤细胞内的H2O2产氧[26]，上述结果意味着USTM-3具有改善乏氧肿瘤细胞中溶氧量的潜质.图6c显示，H2O2的浓度越大，USTM-3在产氧反应后的上转换发光越强，且强度逐渐接近UST的发光，表明H2O2对MnO2的消耗可以抑制UCNPs到MnO2的荧光共振能量转移.这一现象可以确保光敏剂在催化产氧后仍具有在NIR光下产生ROS的能力[16]，同时也为通过测定发光强度的变化评判光敏剂在肿瘤组织的产氧进程提供了一种可能的途径.

a:不同光敏剂催化1 mmol/L H2O2产氧;b:USTM-3催化不同浓度H2O2产氧;c:USTM-3在反应前后的上转换发光光谱

2.5 USTM组成和H2O2添加对ROS产生影响

图7 H2O2对USTM降解RhB性能的影响

表1 不同材料在NIR光照射下氧化降解RhB的效果

2.6 ROS的鉴定

进一步借助探针DPBF检测了USTM在NIR光下产生1O2的能力.如图8b所示，在光照105 min时，USTM-3对DPBF的降解效率(19%)约为UST(12%)的1.5倍.当添加H2O2时，USTM-3的催化产氧和转化O2为1O2的性能显著提高了其产生ROS的能力，DPBF的降解率增加至56%，约为UST产生1O2能力的3.8倍.上述结果意味着USTM具有利用肿瘤微环境的特征产氧并增强产生ROS的潜力[26].

a:捕获剂对USTM-3降解RhB的影响; b:UST和USTM-3降解DPBF的性能

3 结 论

本文成功制备了MnO2负载的近红外光驱动纳米光敏剂USTM.MnO2负载量不超过4.4%的光敏剂具有均匀的形貌，在水溶液中具有良好的分散效果和较窄的粒径分布.MnO2的负载使光敏剂可以在弱酸性溶液中催化H2O2分解产生O2，提升光敏剂在近红外光下产生ROS的能力.上述性能表明，USTM是一种能响应肿瘤微环境、具有增强ROS产生能力的近红外光驱动纳米光敏剂.考虑到近红外光具有良好的穿透能力，进一步研究USTM的生物毒性和对模型肿瘤细胞的体外治疗性能，将有助于更好地评估该光敏剂用于深组织下乏氧肿瘤光动力治疗的可能性.