天祝白牦牛IFN-γ、IL-2和MHC抗病基因多态性研究

吴贝宁，鲁媛媛，高 原，张雅欣，王进娥，霍生东

（西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

白牦牛是世界上罕见的牦牛地方类群和遗传资源，被列为国家级家畜品种，并享有“高原白珍珠”之称。牦牛具有耐寒、耐粗、耐劳、耐缺氧等特点，可以利用其他家畜无法利用的高寒草场牧草资源，为农牧民提供肉、乳、毛皮、役力等生产资料和生活资料[1]。有研究报道，动物对多种疾病的抵抗力在一定程度上取决于基因。因此，通过发现抗病基因来进行抗病育种，可以提高动物的免疫力，降低药物用量，从而推动畜牧业健康可持续发展。

干扰素（interferon,IFN）主要来源于T淋巴细胞，是一种具有抗病毒、抗肿瘤、提高免疫力的蛋白质因子。干扰素家族[2]是出现最早且作用最快的一种抗病毒体系。根据IFN的结构及抗原性，可以将其分为IFN-a、IFN-β、IFN-γ三大类；按照受体类型，可以分为I型IFN和Ⅱ型IFN，I型IFN包含IFN-a、β等[3]，Ⅱ型IFN只有IFN-γ一种类型，又称为免疫干扰素，且与机体免疫功能调节相关[4]。研究发现，除了以上两种之外，根据IFN与其受体的结合方式，又可分为三种类型，即IFN-A1、IFN-A2、IFN-A3。

目前已有研究表明，IFN基因对肿瘤细胞的生长及抗病毒感染都有一定作用。Guzman等[5]通过对牛IFN基因和抗病毒作用的研究发现，牛BoIFN-γ对水泡性口炎病毒有明显的抑制作用，且具有3个抗病毒活性区段。说明该基因可能与牛对病毒的抗性有关联，并且此基因与牛的抗病毒能力存在一定关系。

白细胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）是趋化因子家族的一种细胞因子，它能促进活化的T细胞生长和分化，增强T细胞的杀伤活性、分化及增殖能力[6]。已有研究表明，IL-2直接或间接的具有生长因子和分化信号[7]，其作用机制可能与Tc细胞的增殖有关[8]。但目前关于IL-2基因多态性的相关研究较少。

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）是超基因家族中的一个大类[9]。牛的MHC又被称为BoLA基因[10]。MHC是影响免疫反应和识别的重要因素，它与动物的易感性和抗性有关，是一种具有重要意义的抗性遗传基因。另外，已有研究显示，MHC基因多态性与许多疾病的耐受性及敏感性相关，如口蹄疫[5]、乳腺炎[11]等。

本试验以天祝白牦牛为研究对象，通过对与动物抗病力密切相关的IFN-γ、IL-2和MHC基因的多态性进行研究，为研究天祝白牦牛抗病机制提供理论基础，为牦牛健康养殖和绿色养殖提供科学支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验对天祝藏族自治县13只健康白牦牛（2～5岁）进行颈静脉采血，每只3 ml，所采集的样品具有品种的典型特征。采集的牦牛血使用EDTAK2进行抗凝，再低温送回实验室于-20 ℃保存，备用。

1.2 血液DNA的提取

按照购买的DNA试剂盒说明书，提取牦牛的基因组DNA，将得到的基因组DNA分成两份，一份-20 ℃保存，另一份用来PCR扩增，然后使用UV1800紫外分光光度计和1%的琼脂糖凝胶电泳检验血液DNA的浓度和纯度。

1.3 引物设计及目的片段扩增

根据NCBI上已公布牛MHC（Gene ID：282530）、牛IFN-γ（Gene ID：102267095）和牛IL-2（Gene ID：102272426）基因DNA的参考序列，利用在线软件Primer-Blast设计引物，引物信息见表1，对基因部分的外显子和内含子设计序列。引物由北京奥科鼎盛生物科技公司合成。

表1 基因引物序列

PCR反应体系（25 μl）：2×F8 Master Mix 12.5 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μl，基因组DNA 4 μl，灭菌超纯水7.5 μl。经过多次摸索最终确定反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性10 s，65.4 ℃/63.5 ℃/66 ℃退火30 s，72 ℃延长1 min，4 ℃保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳法对扩增产物进行检测。

1.4 PCR-SSCP检测

取6 μl变性上样Buffer置于PCR管内，加入PCR反应产物，振荡混匀，98 ℃水浴10 min变性后，迅速取出冰浴8 min。将PCR产物与变性buffer混合液上样至加样孔，然后在聚丙烯酰胺凝胶中160 V电泳，电泳结束后，将凝胶取出进行染色。主要过程：先用蒸馏水清洗2遍，将凝胶放在染色盘并倒入染色液，放置在水平摇床上摇晃15 min，确保染色均匀，染色后用双蒸水洗胶，倒入显色液，溶液变黑，倒出，再用双蒸水清洗，再次倒入适量的显色液在摇床上摇晃30 min，待DNA条带合适，用双蒸水终止显色，并拍照保存。

2 结果

2.1 DNA提取结果

利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA，结果如图1所示。所提取的DNA条带清晰，说明血液DNA质量良好，可用于后续试验。

图1 牦牛血液DNA提取结果

2.2 牦牛基因扩增结果

根据表1所列引物信息，对反应条件进行多次优化，最终确定最优条件，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测牦牛IFN-γ、IL-2、MHC基因的PCR扩增产物，结果如图2～4所示，各基因扩增片段大小均与预期相符，且条带清晰，特异性良好，可用于后续SSCP检测。

图2 IFN-γ基因扩增结果

图4 MHC基因扩增结果

2.3 SSCP检测结果

2.3.1IFN-γ基因检测结果 对扩增IFN-γ基因进行SSCP检测，结果显示所扩增的IFN-γ基因出现一种带型（图5），命名为AA。

图5 IFN-γ基因扩增片段SSCP检测结果

2.3.2IL-2基因检测结果 对扩增IL-2基因进行SSCP检测，结果显示所扩增的IL-2基因无多态性表现（图6），命名为BB。

图6 IL-2基因扩增片段SSCP检测结果

2.3.3MHC基因检测结果 对扩增MHC基因进行SSCP检测，结果显示所扩增的MHC基因出现两种带型（图7），分别命名为TT和TA型。

图7 MHC基因扩增片段SSCP检测结果

3 讨论

本试验所用区段IFN-γ表现出一种带型，在以往试验中已经证明[12]，IFN-γ可以协同间充质干细胞发挥免疫抑制作用，而间充质细胞可以有效促进造血干细胞移植，提高成功率，减少移植物抗宿主病。根据此试验结果，可以试着将IFN-γ用于协同免疫抑制，从而提高临床治疗效果。Shaoyong Li等[13]研究表明，IFN-α负载的SLN可能是兽医治疗中有用的配方。Xiju Shi等[14]对MDBK/VSV细胞株进行了抗病毒活性测试，结果表明，6种重组的IFN-α（rIFN-α）对MDBK/VSV细胞株的抑制作用均比CEF/VSV强1 000倍以上。另外，rIFN-αs可以通过利用CPE抑制MDBK细胞株中感染性牛鼻气管炎病毒的复制和增殖。结果表明，rIFN-αs是一种具有广阔应用前景的新型抗病毒药物，它具有很好的生物活性和广谱效应。

本试验未检测出IL-2基因具有多态性，这可能是由于基因具有保守性或样本量较小影响多态性的检出。付满良等[15]研究成功克隆了牦牛IL-2基因，其原核表达产物对牦牛具有显著的免疫活性，为研制新型免疫增强剂提高牦牛的抗病能力和增强牦牛疫苗的免疫保护率奠定了良好基础。同时白细胞介素IL-2能够抑制肿瘤细胞的生长[16]。

MHC在本试验中表现出高度多态性。Othman[17]研究结果显示，不同的MHC基因型可能对提高埃及水牛特别是埃及流行的O型口蹄疫病毒有很大帮助。乳房炎是奶牛生产中最普遍的一种疾病，是造成奶牛业经济损失的重要原因之一[18]。DRB3基因是动物免疫系统中一个重要的多态性基因，多态性最为丰富的基因位点可在动物的免疫系统中高度表达，与许多疾病的耐受性、易感关系密切。由此推断，MHC基因的多态性与隐性乳房炎有一定关系，这对奶牛隐性乳房炎的预防和治疗具有一定的参考价值。

4 结论

本试验对IFN-γ、IL-2和MHC基因的多态性与牦牛抗病之间的关系进行了研究，结果显示：IFN-γ只有一种基因型，IL-2未检测出基因型，MHC具有两种基因型。因此，天祝白牦牛抗病性主要与MHC基因的表达密切相关。