除草链格孢菌HY-02的培养和发酵条件优化

李祥，朱海霞

（1.青海大学，青海 西宁 810016；2.青海省农林科学院，青海 西宁 810016；3.农业部西宁作物有害生物科学观测实验站，青海 西宁 810016；4.青海省农业有害生物综合治理重点实验室，青海 西宁 810016）

农田杂草是危害农作物产量和品质的罪魁祸首之一［1］，近年来我国农田草害发生面积约为9 246.7万hm2［2］，大大降低了农作物的收获量。目前，杂草防除主要使用化学农药，造成了严重的环境污染，打破了生态平衡［3］。化学农药的副作用，使得人们对开发生防制剂产生了更大的兴趣［4］。微生物除草剂的产生，极大地改善了农田药害问题，使得生物防治成为了农田病虫草害的最佳防治技术［5］。

前人对于微生物除草剂的报道已经有很多。例如，强胜等［6］开发研制出的生物除草剂杀草毒素AAC-Toxin对杂草的防效两天内达100%。陈超［7］研究发现，从特定环境中筛选出了具有生防潜力的毛壳菌，该菌可以诱导植物产生抗性。Thomas等［8］发现了一种马缨丹柄锈菌可以防治马缨丹，尤其在热带雨林地区特别成功。从向日葵上分离的镰刀菌属（Fusariumsp.）真菌能抑制列当种子的萌发［9］。埃及科学家筛选出的链格孢属真菌（Alternaria alter⁃nate）可有效控制水葫芦，从该菌中分离得到的毒素还可以破坏某些植物的光合作用，例如紫茎泽兰（Eupatorium edenophorum），从而对其产生毒害［10］。

随着发酵技术的日趋优化和成熟，优化工艺配方为微生物除草剂的生产提供了技术支持，是微生物除草剂实现产业化生产的关键，为生物农药提供了前所未有的发展契机［11］。梁玎玎［12］研究发现草茎点霉（Phoma herbrum）SYAU-06菌株经过发酵优化制成水乳剂对盆栽鸭跖草（Commelina communis）的防治效果达到51.36%。Li等［13-14］利用固体发酵方式对毛壳霉属和曲霉属真菌进行发酵，从其代谢产物中分离得到了抗肿瘤物质。王国平等［15］为了提高木霉菌素的产量，通过优化得到了最佳培养基配方。朱海霞等［16］利用正交设计法对极细链格孢的最适碳氮源、初始含水量、接种量等优化获得了菌株发酵所需的最佳条件。

除草活性链格孢（Alternaria alternate）真菌HY-02菌株是从青海省湟源县波航乡采样，由自然感病的巴天酸模（Rumex patientiaL.）叶片分离得到，经过前期致病性和作物安全性研究发现，该菌株对恶性阔叶杂草藜（Chenopodium album）、猪殃殃（Galium spurium）、萹蓄（Polygonum aviculare）、酸模叶蓼（Polygonum lapathifolium）、冬葵（Malva verticillata）、密花香薷（Elsholtzia densa）均具有不同程度的致病性，对禾本科作物小麦、青稞表现安全。为了明确该菌株发酵所需的培养基配方和发酵工艺，本研究通过对HY-02菌株进行发酵条件优化，旨在探究该菌株的最佳产孢量以及最佳发酵条件，为探究其除草活性组分奠定基础，为下一步将其制成生防除草剂提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

菌株HY-02从自然感病的巴天酸模分离得到，此菌株被鉴定为链格孢（Alternaria alternate）真菌，将菌株培养于PDA斜面上，保存于青海省农科院植保所有害生物综合防治实验室。

1.2 菌株培养

取斜面上培养的菌丝于PDA培养基上培养5 d，备用。

1.3 试验方法

1.3.1 固体培养基的筛选 选择7种不同的固体培养基（表1），将培养好的菌株打菌饼（Φ=8 mm），接于7种培养基平板中央，放在25℃培养箱中培养7 d，每天观察并测量其菌落直径及菌落形态，重复3次，选择长势（菌落直径和菌丝形态）最好的培养基为固体基础培养基。

表1 供试培养基及其配方Table 1 Test medium and its formula

1.3.2 培养基的优化 以察氏培养基为基础培养基，对培养基各成分进行单因素试验。将活化的培养基中打菌饼（Φ=8 mm）接于装有基础培养液的三角瓶（250 mL）中，于25℃、180 r/min条件下摇床培养7 d，测定最大吸收波长λ=640 nm的D值，重复3次。培养基各成分及水平选择如表2所示。

表2 单因素试验及水平Table 2 Factors and levels of single factor test (g·L-1)

1.3.3 成分及配比优化 根据中心组合设计原理，对碳、氮源及无机盐进行成分配比优化，以单因素结果为中心点，菌株HY-02的D（D=600 nm）值为响应值（Y），设计3因素3水平的响应面（RSM）试验，其因素及水平如表3所示。

表3 中心复合设计试验因素及水平Table 3 Test factors and levels of central composite design

1.3.4 发酵条件优化 以优化的培养基为发酵培养基，分别测定不同培养温度（22、25、28、31和34℃）、摇床转速（150、165、180、195和210 r/min）、初始发酵时间（1、2、3、4、5、6和7 d）、pH（5、6、7、8和9）和装液量（75、100、125、150、175、200和225 mL/瓶）对菌株HY-02的OD值的影响，每处理重复3次。

1.4 统计分析

采用DPS 9.0、Design Expert 12和Excel对试验数据进行统计分析，采用新复极差法比较差异显著性。

2 结果与分析

2.1 培养基的筛选

7 d后，菌株HY-02在7种培养基上的形态如图1所示，在PDA培养基上，菌落呈灰色，气生菌丝不发达，边缘不整齐，菌丝呈絮状；在PSA培养基上，菌落呈灰黑色，菌落边缘整齐，气生菌丝发达，菌丝呈絮状；在NB培养基上，菌落呈黄褐色，气生菌丝发达，菌丝呈绒毛状；在察氏培养基上，菌落白色，呈绒毛状，长至后期颜色变为粉红色，菌落边缘整齐，气生菌丝发达；在孟加拉红培养基上，前期菌落表面呈白色，后期呈黄色，菌丝呈绒毛状边缘整齐，气生菌丝不发达，菌落不扩大生长；在培养基Ⅰ上，菌落呈白色，菌丝呈雪花状，边缘不整齐，后期菌丝体退化；在培养基Ⅱ上，菌落呈灰白色，边缘不整齐，菌丝呈絮状，气生菌丝不发达，生长后期凹凸不平。

图1 菌株HY-02在不同基础培养基上菌落形态Figure 1 Colony morphology of strain HY-02 on different basic media

菌株HY-02在7种培养基上菌落直径大小比较如图2和表4所示，5 d后，察氏培养基中菌落直径最大，为5.70 cm；孟加拉红培养基中直径最小，为3.03 cm；7种培养基菌落直径之间差异显著。7 d后，7种培养基菌落直径相比较差异显著，察氏培养基中菌落直径最大，为7.50 cm；菌丝体发达如图1所示。

图2 菌株HY-02在不同培养基上的菌落直径比较Figure 2 Comparison of colony diameter of strain HY-02 on different media

表4 菌株HY-02在不同培养基上的菌落直径比较Table 4 Comparison of colony diameter of strain HY-02 on different media

2.2 培养基单因素优化

2.2.1 蔗糖 由图3-A可知，随着蔗糖含量增加，菌株HY-02的D值先降低后增加，当蔗糖的含量是70 g/L时，D值最大，之后随蔗糖含量增加，D值减小。说明70 g/L的蔗糖为菌株HY-02发酵的最适碳源量。

2.2.2 硝酸钠 由图3-B可知，随着硝酸钠含量增加，菌株HY-02的D值先增加后降低，当硝酸钠含量为12 g/L时，D值最大，之后随硝酸钠含量增加，D值减小。说明12 g/L的硝酸钠为菌株HY-02发酵的最适氮源量。

图3 菌株HY-02在不同蔗糖和硝酸钠含量发酵液中的D值Figure 3 D value of strain HY-02 in fermentation broth with different sucrose and sodium nitrate content

2.2.3 K2HPO4由图4-A可知，随着无机盐K2HPO4含量的增加，菌株HY-02的D值先增加后降低，当K2HPO4含量为6 g/L时，D值最大，之后随K2HPO4含量增加，D值减小。说明6 g/L的K2HPO4为菌株HY-02发酵的最适含量。

2.2.4 KCl由图4-B可知，随着KCl含量增加，菌株HY-02的D值先降低后增加，当KCl为1.5 g/L时，D值最大，之后随KCl含量增加，菌株HY-02D的D值先降低再增加又降低。说明1.5 g/L的KCl为菌株HY-02发酵的最适含量。

图4 菌株HY-02在不同K2HPO4和KCl含量发酵液中的D值Figure 4 D value of strain HY-02 in fermentation broth with different potassium hydrogen phosphate and potassium chloride content

2.2.5 MgSO4·7H2O 由图5-A可知，随着MgSO4·7H2O含量增加，菌株HY-02的D值先降低后增加，当MgSO4·7H2O含量为2.0 g/L时，D值最大，之后随着MgSO4·7H2O含量增加，D值先增加后减小。说明2.0 g/L的MgSO4·7H2O为菌株HY-02发酵的最适含量。

2.2.6 FeSO4由图5-B可知，随着FeSO4含量增加，菌株HY-02的D值呈增加趋势，当FeSO4含量为0.04 g/L时，D值最大，之后随FeSO4含量增加，D值先减小后增加。说明0.04 g/L的FeSO4为菌株HY-02发酵的最适含量。

图5 菌株HY-02在不同MgSO4·7H2O和FeSO4含量发酵液中的D值Figure 5 D value of strain HY-02 in fermentation broth with different magnesium sulfate heptahydrate and ferrous sulfate content

2.3 成分配比及优化

根据单因素优化结果，对菌株HY-02的液体培养条件，利用中心组合试验设计3因素3水平试验，结果如表5所示。

表5 中心组合试验设计与结果Table 5 Design and results of central composite test

以菌株HY-02发酵液的D值（Y）为响应值，根据中心组合的试验结果（表6）进行分析得到D值与蔗糖（A）、NaNO3（B）、无机盐（C）的二次多项回归方程：

通过方差分析上述回归模型可知（表6），回归模型的P=0.001 5，失拟项的P值0.099 4>0.05，模型回归检验极显著，失拟检验不显著，说明未知因素对试验的干扰很小，模型稳定，回归方程的决定系数为94.23%，说明该方程与实际情况符合，反映了菌株HY-02的D值与碳源、氮源和无机盐之间的关系，该模型能够对菌株HY-02的D值进行分析和模拟。

表6 回归模型方差分析Table 6 Analysis of variance of regression model

模型数据显示，一次项B及交互项AB、AC及二次项A2、B2、C2影响显著，各因子的影响主次顺序：C2>B2>A2>B>AB>AC>BC>A>C。

根据试验因素间交互效应三维立体响应面和等高线图（图6~8），在确定一个因素的情况下，观察其他两个因素对OD值的影响，蔗糖、硝酸钠、无机盐三者交互作用响应面为开口向下的凸形曲面，且交互效应的等高线形状为圆形，说明两两之间的交互作用效果较显著。利用回归方程得到菌株HY-02液体发酵培养基产孢量的培养基条件为：蔗糖79.789 g/L，硝酸钠8.763 g/L，无机盐5.472 g/L（其中K2HPO43.442 g/L、KCl 0.860 g/L、MgSO4•7H2O 1.147 g/L、FeSO40.0229 g/L）。

图6 蔗糖含量和硝酸钠含量交互作用对D值影响的响应面图（左）和等高线（右）Figure 6 Response surface（left）and contour（right）of interaction between sucrose content and sodium nitrate content on D value

2.4 发酵条件优化

2.4.1 发酵温度 由图9-A可知，随着发酵温度的升高，菌株HY-02的D值呈增加趋势，当温度为25℃时，D值最大，之后随温度的升高，D值减小，说明25℃为最佳发酵温度。

图7 蔗糖含量和无机盐含量交互作用对D值影响的响应面图（左）和等高线（右）Figure 7 Response surface（left）and contour（right）of interaction between sucrose content and norganic salt content on D value

图8 硝酸钠含量和无机盐含量交互作用对D值影响的响应面图（左）和等高线（右）Figure 8 Response surface（left）and contour（right）of interaction between sodium nitrate content and norganic salt content on D value

2.4.2 转速 由图9-B可知，随着转速的增加，菌株HY-02的D值也随之升高，当转速达到165 r/min时，菌株HY-02的D值达到最大，之后随转速增加，D值逐渐减小。故菌株HY-02的最适转速为165 r/min。

图9 发酵温度和转速对菌株HY-02 D值的影响Figure 9 Effect of fermentation temperature and rotation speed on D value of strain HY-02

2.4.3 装液量 根据锥形瓶容量的不同分别设置不同梯度的装液量，由图10-A可知，随着装液量的增加，菌株HY-02发酵液的D值先增加后减小，当装液量为200 mL/瓶时，菌株HY-02的D值最大，之后随装液量增加，D减小。说明最适装液量为200 mL/瓶。

2.4.4 发酵时间 分别于不同发酵时间测定菌株HY-02的OD值。由图10-B可知，在发酵时间为1~3 d，菌株HY-02的D值先减小后变大，当菌株发酵到第4天时，菌株的D值达到最大值，之后随时间变长，D值先减小后增加，但第7天测得的D值较最大值略小，所以，选择发酵时间为4 d作为菌株HY-02的最适发酵时间。

图10 装液量和发酵时间对菌株HY-02 D值的影响Figure 10 Effect of liquid volume and fermentation time on D value of strain HY-02

2.4.5 pH 分别设置不同的pH梯度测定菌株HY-02的D值。由图11可知，随pH值增加，菌株D值呈增加趋势，当pH=7时，菌株D值最大，之后菌株D值也变小。故选择pH=7为该菌株最适pH。

图11 PH对菌株HY-02 D值的影响Figure 11 Effect of pH on D value of strain HY-02

3 讨论与结论

微生物除草剂不仅可以消除化学农药的抗药性、残留等缺点，而且可以弥补菌株退化、货架期短等的不足，为农业生产带来很多便利。微生物的发酵会受到碳氮源、基质含水量、发酵温度、发酵时间、转速、pH等发酵条件的影响，不同因素对菌体生长和产物合成产生不同的影响差异［17-18］。通过微生物发酵条件优化，既能提高菌剂的防效，又能促进活性物质的产生［19-20］。

前人利用固体和液体发酵方式获得活性物质，例如Abouzied等［21］利用大米为基础培养基对不同镰刀菌进行发酵优化，并分离出了化合物。Ahsan等［22］筛选了链霉菌（Streptomycessp.）TA 1123菌株，并对其进行发酵条件的优化，提高了菌株TA 1123的抗生素产量和质量。在本研究中，菌株HY-02的最适碳源为蔗糖，这与杜艳丽等［23］的研究结果一致。尹艳楠等［24］对蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）NJSZ-13菌株进行优化，其用pH=7的条件发酵菌株，使菌株产孢量增加，与本研究结果相似。朱海霞等［25］通过对具有除草活性的生防菌株HZ-31进行发酵条件优化，选择无机氮源作为发酵优化的最适氮源与本研究结果一致，能够增加菌株HY-02的产孢量。杨莹等［26］利用中心组合优化PA-2菌株所用的无机盐，与本研究中所采用的无机盐的作用相似，均能起到调节作用，能促进菌株产孢。本研究利用7种不同固体培养基筛选得到最适培养基为察氏培养基，以察氏培养基为基础，对各组分进行优化得到最佳配比（蔗糖：79.789 g/L，NaNO3：8.763 g/L，无机盐：5.472 g/L），为除草活性物质的分离和纯化奠定了基础。

本研究对菌株HY-02发酵条件进行优化，得到最佳碳、氮源及无机盐的成分配比为：蔗糖：79.789 g/L，NaNO3：8.763 g/L，无机盐：5.472 g/L（其中K2HPO43.442 g/L、KCl 0.860 g/L、MgSO4•7H2O 1.147 g/L、FeSO40.022 9 g/L）。最适发酵条件为：温度25℃，转速165 r/min，装液量200 mL，发酵时间4 d、pH=7。菌株HY-02的液体发酵优化，为菌株的液体发酵提供了最优配方和条件，但未对固态发酵条件探索，是否满足工业生产和田间防除杂草还需要更多的发酵数据去验证。下一步将对该菌株的剂型、田间药效、除草机理等进行系统研究，为该菌的剂型研究以及以后菌剂的规模化生产提供技术参考，为菌株HY-02开发出新型生物除草剂奠定基础。