环介导等温扩增技术检测慢性阻塞性肺疾病伴下呼吸道感染病原菌397例价值研究

2022-08-31 02:04温雅黄娟杜焰家张伟强曾汉华朱旭华钟子双
安徽医药 2022年9期
关键词:阳性率病原菌杆菌

温雅,黄娟,杜焰家,张伟强,曾汉华,朱旭华,钟子双

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种常见的慢性气道炎症,目前死亡率居全球第4 位。我国COPD的患病率及死亡率呈逐年上升趋势,其诊治为人们和社会带来沉重的经济负担[1]。COPD 病程分为稳定期和急性加重期,下呼吸道感染是导致COPD 急性加重期(AECOPD)发生的重要原因,AECOPD 病人往往需要住院诊治,或并发呼吸衰竭、肺性脑病、肺源性心脏病等严重并发症,甚至需要呼吸机辅助通气治疗。据统计分析,COPD 伴下呼吸道感染病原体中细菌感染占约40%~50%,而且不同病程、基础肺功能的AECOPD 下呼吸道感染的病原菌种类和分布均不同[2]。传统细菌培养方法检测时间长,阳性率低,尤其对一些苛养菌的培养条件要求高,未能及时提供感染菌的临床证据,而环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是通过检测病原菌核酸的分子生物学方法,能快速、灵敏地检测出感染病原菌,常在24 h 内就能检测出相应结果,在呼吸道感染早期阶段就能及时提供病原学证据,指导临床抗生素的使用[3]。LAMP检测方法近几年逐渐普及临床应用[4-6],但其对COPD伴下呼吸道感染病原菌的检测情况尚未见有文献报道。故此,本研究通过回顾性探讨LAMP(13 联)检测方法对COPD 伴下呼吸道感染的病原菌的临床应用价值,主要是针对呼吸道细菌和非典型病原体感染的COPD病人。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性选取梅州市人民医院2018年1 月至2020 年12 月诊断为COPD,临床诊断伴有急性下呼吸道感染,符合纳入与排除标准,临床症状和检查结果提示伴有下呼吸道感染,且接受抗生素治疗的病人共397例,其中入住普通病房,包括呼吸内科(2019 年改名为呼吸与危重症医学科)、中医科、全科医学科、感染性疾病科,均未接受呼吸机辅助通气治疗的病人共195 例,男177 例,女18 例,年龄(71.73±8.83)岁;入住重症监护室(ICU),因病情需要接受呼吸机辅助通气的病人有202 例,男179例,女23例,年龄(73.86±9.31)岁;两组病人的性别、年龄比较差异无统计学意义(χ2=0.50,P=0.481;t=0.90,P=0.371)。本研究经梅州市人民医院医学伦理委员会审核批准(梅市伦审2020-CY-18)。

纳入标准:①年龄范围为18~100 岁;②根据我国COPD 基层治疗指南《慢性阻塞性肺疾病基层诊疗指南(实践版·2018)》[7]诊断为COPD,临床症状表现为咳嗽、咳黄脓痰、气促加重,和/或伴有发热、意识障碍等,检查结果如影像学提示肺部感染,血清炎症指标升高,提示伴有下呼吸道细菌或非典型病原体感染的病人;③经病人和/或近亲属同意留取痰液/支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)/支气管吸出物送检LAMP(13 联)检测和传统培养检测;④临床上均选用敏感抗生素抗感染治疗,且治疗有效果。排除标准:①合并活动性肺结核、肺癌、严重心肺功能障碍、凝血功能障碍的病人;②不同意留取痰液/BALF/支气管吸出物送检LAMP(13 联)检测和培养检测的病人;③临床资料不完整或缺失病人;④痰液/BALF/支气管吸出物不符合临床检验标准的病人。

1.2 方法检测标本的获取:自主咳痰能力尚好的病人入院(入住普通病房和ICU)后24 h内在医务人员指导下咳出深部痰液;年龄大或咳嗽能力差的病人则经过支气管镜吸出深部痰液或经过支气管肺泡灌洗留取BALF,操作符合《全国临床检验操作规程》[8],获取合格标本,并于2 h内送检。

LAMP(13 联)检测方法:所用方法为呼吸道病原菌核酸联合检测项目。首先需提取标本里病原菌DNA,病原菌基因组DNA的提取采用博奥生物公司生产的细菌DNA 提取试剂盒,按照厂家推荐的方案进行。通过检测光密度(OD)260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm,使用Nanodrop 2000 TM 分光光度计(ThermoFisher Scientific 生产)对纯化DNA 样品的质量和浓度进行测量和评估。分离的DNA 保存在-20 ℃,待进一步使用。采用呼吸道病原菌核酸检测试剂盒(博奥生物公司,中国北京)按照说明书,采用等温扩增法和微流控芯片法相结合的方法,对病原菌进行LAMP检测。采用呼吸道病原菌核酸检测软件对检测结果进行可视化分析。检测到13 种检测细菌病原体:肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核分枝杆菌复合群。

传统培养方法:按照临床常规细菌/真菌培养操作标准,标本被接种在已处理的培养皿,经孵化35 ℃恒温培养箱,细菌检测使用VITEK2 BioMerieux(法国)自动细菌分析仪,真菌检测使用真菌分析仪。

1.3 统计学方法应用SPSS 23.0 软件进行统计,均以P<0.05 为差异有统计学意义。其中计量资料以± s表示,采用两独立样本t检验;计数资料以例数或构成比表示,采用χ2检验,配对样本间率的比较采用配对χ2检验;一致性检验采用Kappa 检验,Kappa≥0.75时表示两者的一致性较好,0.40≤Kappa<0.75 时一致性一般,Kappa<0.40 时表示两者的一致性较差。以统计学定义计算LAMP检测方法的灵敏度、特异度。

2 结果

2.1 感染病原菌LAMP 方法与传统培养结果的比较入住普通病房和ICU 的COPD 伴下呼吸道感染的LAMP 方法检测阳性率分别为45.13%、47.03%,均高于传统培养方法阳性率分别为9.74%、16.83%(χ2=9.72、9.99,P<0.001)。结合数据看,LAMP 方法阳性检出率均偏高,提示有一定误差。ICU 病房与普通病房LAMP检测阳性率比较差异无统计学意义(χ2=1.44,P=0.704),ICU 病房传统培养结果阳性率高于普通病房(χ2=4.04,P=0.038)。详见表1,2。

表1 普通病房COPD 195例感染病原菌LAMP与传统培养结果/例(%)

表2 ICU病房COPD 202例感染病原菌LAMP与传统培养结果/例(%)

2.2 LAMP 方法的灵敏度和特异度以传统培养结果为标准,LAMP 方法对普通病房和ICU 病房的COPD 病人感染病原菌检测的灵敏度分别为78.95%(15/19)、85.29%(29/34),特异度分别为58.52%(103/176)、60.71%(102/168)。具体例数见表1,2。

2.3 不同标本的LAMP 方法检测结果普通病房COPD 病人共收集180 份痰液、16 份BALF(共计196份标本),其中痰液的阳性率为47.22%,BALF 的阳性率为25.00%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);ICU 病房COPD 病人共收集199 份痰液,4 份BALF(共计203 份标本),其中痰液的阳性率为47.73%,BALF 的阳性率为25.00%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4 普通病房和ICU COPD 病人感染病原菌LAMP检测结果的比较根据LAMP(13联)检测结果,入住普通病房的COPD 伴下呼吸道感染病人的病原菌排在前三名为流感嗜血杆菌34例(17.44%)、耐甲氧西林葡萄球菌25例(12.82%)、铜绿假单胞菌13 例(6.67%)、肺炎链球菌13 例(6.67%);入住ICU的COPD 病人感染的病原菌排在前三名的为耐甲氧西林葡萄球菌43 例(21.29%)、流感嗜血杆菌14 例(6.93%)、肺炎链球菌13 例(6.44%)。其中,ICU 病房病人的耐甲氧西林葡萄球菌阳性率高于普通病房(P<0.05),普通病房病人中流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌阳性率高于ICU病房(P<0.05)。见表4。

表3 普通病房/ICU病房COPD病人不同标本感染病原菌LAMP检测结果比较/份(%)

2.5 不同病房COPD 感染病原菌培养结果分布特点普通病房和ICU 的COPD 伴下呼吸道感染的病原菌种类、例数和构成比,均以铜绿假单胞菌居首位,其次是肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌。除了常见菌株外,还有较少见的产气肠杆菌、纹带棒状杆菌、葡萄牙棒孢酵母,真菌主要有白丝酵母菌、曲霉菌。见表5。

2.6 LAMP(13 联)检测方法与传统培养方法的一致性分析普通病房病人中铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的Kappa 值分别为0.62、0.59;ICU 病房病人中铜绿假单胞、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌的Kappa值分别为0.87、0.76、0.58。见表6,7。

2.7 COPD 病人感染病原菌LAMP 检测与培养阳性结果不相符病例LAMP 方法与传统培养方法阳性结果大多数为一致,仅有8 份病例存在不一致情况。分析可能原因:培养阳性的病原菌不是LAMP检测范围的病原菌,且非典型病原体未能经过传统培养方法获取,可能存在混合感染可能;而有2份病例标本LAMP 检测为肺炎克雷伯菌,培养却为铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌,存在病原菌在检测过程中稳定性不同的原因,需要进一步探讨。见表8。

表4 普通病房和ICU COPD病人感染病原菌LAMP检测结果比较/例(%)

3 讨论

COPD 是常见的慢性气道炎症,是一种不可逆的但可以治疗和预防的慢性呼吸道疾病。吸烟和空气污染导致COPD 发生的重要病因,我们国家吸烟人口基数大,重工业行业正在不断发展强大中,COPD 患病率也在逐年上升[9]。随着医学研究的深入,进一步探究COPD 的发病机制及转化倾向,2021年COPD 全球创议(global initiative for chronic obstructive lung disease,GOLD)提出了COPD 与肺癌的发生密切相关[10]。有研究证实了COPD 病人中肺部微生物组介导的炎症反应是导致肺癌发生的重要原因[11-12],细菌感染也是导致COPD 病情加重、肺功能进一步下降的重要原因。所以,研究COPD 呼吸道感染的病原菌分布特点不仅能为COPD 病人提供治疗的临床依据,更能延缓疾病病程发展的速度,改善病人的预后情况,尽量避免肺癌甚至更多严重合并症的发生。

表5 不同病房COPD感染病原菌培养结果分布特点/例(%)

表6 普通病房COPD病人感染病原菌LAMP和传统培养结果的一致性分析/例

表7 ICU病房COPD病人感染病原菌LAMP和传统培养结果的一致性分析/例

随着分子生物学技术的发展,呼吸道感染病原菌不仅仅只是通过传统培养方法获取,况且传统培养方法往往是耗时长、培养条件要求苛刻,尤其对于一些入院前已经使用过抗生素的病人,经常得到培养阴性的结果,未能及时指导抗生素的选用。对于COPD 伴下呼吸道感染的病人,现临床上通过检测痰液标本病原菌核酸和血清学抗原/抗体的方法,能够快捷有效地提供感染病原菌的证据。本研究采用的LAMP 检测方法是一种新型的核酸扩增方法,LAMP 方法在病原学检测的应用价值已得到肯定,检测范围包括病毒、细菌、寄生虫等,其衍生出来的分子生物学检测方法也在不断更新中[13-15]。此项检查项目在该院的医嘱项目为“呼吸道病原菌核酸联合检测”,即使用呼吸道病原菌核酸检测试剂盒,通过检测病原菌DNA 的方法检测出13 种病原菌。研究对象选择为入住不同病房的COPD 病人,原因是本研究是回顾性分析,病人肺功能检查资料不齐,未能从COPD 的肺功能等级角度分析,而是否使用呼吸机辅助通气取决于COPD 病人的病情严重程度,伴有下呼吸道感染的致病菌的分布特点存在不同,分析结果可以显示不同病情程度的COPD 病人伴有下呼吸道感染病原菌的分布特点,对临床诊疗具有相应价值。从统计结果看出,普通病房和ICU 病房的COPD 病人通过LAMP(13 联)方法检测的病原菌的阳性率分别是45.13%、47.03%,均以单一感染为主,高于传统培养方法(P<0.001),这跟国内的相关研究[5,16-17]结果基本相符。

检测标本采用痰液、BALF、支气管吸出物,以痰液为主,痰液及BALF的LAMP方法检测阳性率均差异无统计学意义,而既往的研究显示痰液的阳性率比BALF 的高[5],因本研究采用回顾性分析,标本的数量差异较大,所以,不同标本的LAMP检测结果仍须进一步研究探讨,本课题组正在进行后续的BALF 呼吸道病原菌核酸检测价值的研究中。普通病房和ICU 的COPD 病人的传统培养阳性率分别是9.74%、16.83%(P<0.05),究其原因为:传统培养阳性率低的原因有该院是地方三级甲等医院,病人在入院前已经使用抗生素治疗;其中入住ICU 的COPD 病人伴有重症呼吸道感染,病人缺失咳嗽、咳痰能力,病情需要无创/有创通气治疗,或者存在呼吸机相关感染的情况,常规采用床边纤维支气管镜获得肺部深部痰液,导致ICU 病房的传统培养方法结果的阳性率高于普通病房。

表8 COPD病人感染病原菌LAMP检测与传统培养阳性结果不相符病例

根据LAMP 检测结果,入住普通病房的COPD伴下呼吸道感染的病人的病原菌排在前三名为流感嗜血杆菌34 例(17.44%)、耐甲氧西林葡萄球菌25 例(12.82%)、铜绿假单胞菌13 例(6.67%)、肺炎链球菌13例(6.67%);而入住ICU的COPD病人感染的病原菌排在前三名的为耐甲氧西林葡萄球菌43例(21.29%)、流感嗜血杆菌14例(6.93%)、肺炎链球菌13 例(6.44%)。入住普通病房的COPD 病人的病情较轻,以社区轻症感染为主,流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌为主,与国内外流行病学调查[18]结果相符,但国内缺少多中心临床研究证据。其中流感嗜血杆菌、肺炎链球菌的培养例数为1、0例,因为流感嗜血杆菌、肺炎链球菌属于导致人类呼吸道感染常见的苛养菌,在普通的培养环境不能生长,需要在培养皿中添加特殊的营养物质[19],LAMP 检测方法对于这种苛养菌的检测具有快速灵敏、经济有效的优势,弥补了传统培养对一些苛养菌不敏感的不足,能够及时获得感染致病菌的证据,指导临床用药。普通病房COPD 病人经LAMP方法检测出有肺炎衣原体、嗜肺军团菌,这两种非典型病原体很难通过传统培养方法检测出,经常通过血清学方法检测出,但血清学检查经常有滞后现象,国内已有研究显示LAMP 方法在检测非典型病原体感染方面具有很大优势[20-21],本研究结果也显示LAMP方法能够检测出呼吸道致病性非典型病原体。入住ICU病房的病人中可见耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)阳性率高(P<0.05),高于普通病房,过去的一些临床研究显示COPD 常见的感染病原菌以革兰阴性菌为主,但是因COPD 呼吸道免疫防御能力的下降、长期吸入或全身使用糖皮质激素、反复住院使用广谱抗生素、合并院内感染,入住ICU 的COPD 常常伴有肺部重症感染,导致条件致病菌MRSA 感染的比例上升,甚至还有一些社区感染的情况发生[22-25],本研究显示普通病房的COPD伴下呼吸道感染菌中MRSA 也位居前列,国外有临床研究显示COPD 是MRSA 感染的独立危险因素[26],但是,MRSA 感染与COPD 的关系仍需更多的临床研究进一步探讨。从上述结果显示,LAMP(13 联)涵盖了COPD呼吸道感染最常见的致病菌,对COPD伴下呼吸道感染病原菌的检测具有灵敏、快捷、有效的优点。

以传统培养结果为标准,LAMP 方法对普通病房和ICU 病房的COPD 病人感染病原菌检测的灵敏度分别为78.95%、85.29%,特异度分别为58.52%、60.71%,LAMP 方法对感染病原菌的检测有比较好的灵敏度,但是因为传统培养结果的阳性率低,不同标本的检测结果有差异,导致特异度低的结果,所以本研究与国内相关研究一样采用一致性检验即Kappa 检验。经LAMP 方法检出铜绿假单胞菌与传统培养检测结果的一致性最高,Kappa 值为0.87,具有较好的一致性,鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌的Kappa 值为0.76、0.58,跟该院LAMP 技术相关研究及国内一些研究结果相符合[5,27],但由于研究人群的不同,呼吸道感染致病菌菌种也有不同,根据既往的研究显示,以痰培养结果统计分析,该院COPD 病人伴有呼吸道感染致病菌以革兰阴性菌为主,铜绿假单胞菌居首位,前五名的还有鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌[28],因上文提到的传统培养方法对苛养菌和非典型病原体培养困难,统计结果可能会偏向容易培养出的致病菌,这也侧面说明了LAMP 方法可以检测出COPD 病人的呼吸道感染致病菌,与痰培养结果有比较好的一致性,弥足了传统培养方法的不足,有效获得COPD 伴呼吸道感染病原菌的证据,指导临床治疗。

此外,此研究有8份病例存在不一致情况,分析可能原因:培养阳性的病原菌不是LAMP 检测范围的病原菌,特别是以真菌为主,且非典型病原体未能经过传统培养方法获取,可能存在混合感染可能;而有2 份病例标本LAMP 检测为肺炎克雷伯菌,培养却为铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌,存在病原菌在检测过程中稳定性不同的原因,需要进一步探讨。

综上所述,LAMP方法在COPD人群中伴有下呼吸道感染病原菌的检测方面具有灵敏、快捷的优势,尤其是对于难以培养出的苛养菌和非典型病原体的灵敏度高,能及时为COPD 病人的治疗提供临床依据,具有非常重要的临床意义,应该普及临床应用。我们课题组主要是针对LAMP 检测方法对COPD 伴急性下呼吸道感染病原菌应用价值研究,通过上述结果可以分析该院LAMP检测方法的运用状况,分析不同呼吸道标本的检测情况,我们也正在进行BALF 呼吸道病原菌核酸检测价值的研究。本研究也有不足之处,比如样本量较少,因回顾性分析缺失COPD 合并结核分枝杆菌感染的资料,COPD 伴下呼吸道感染病原体还包括一些不常见的菌群或真菌或病毒感染,需要联合其他检测方法。虽然LAMP 方法目前在临床应用上比较广泛,但仍需要更多的临床研究去探讨其临床应用价值,促进分子生物学检测技术不断更新及改进,为病人的临床诊治带来更多益处。

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