2018 ～2020 年昆明市淋球菌耐药监测结果分析

曾志君，杨 敏，郭明天，卢 赞，董桂琼，陈会超，孙鹏艳，陈 敏，杨 莉

（1.云南省疾病预防控制中心性病艾滋病防制所，云南 昆明 650022；2.中国医学科学院医学生物学研究所，云南 昆明 650118；3.昆明市第一人民医院检验科，云南 昆明 650011；4.昆明市官渡区人民医院，云南 昆明 650220）

淋病是由淋病奈瑟球菌（以下简称淋球菌）感染引起的一种性传播疾病。2020 年我国淋病报告的发病数为105160 例，位居法定报告乙类传染病的第4 位，发病率为7.4909 例/10 万人［1］。云南省近年来淋病发病率持续上升［2］，2020 年的发病率达14.0274/10 万，远高于全国水平。目前抗菌药物治疗是控制淋病最直接和有效的手段，然而抗生素的滥用导致了耐药淋球菌不断出现并流行传播［3］，对有效控制淋病的流行造成了严重的威胁。我国早在1987 年就建立了以实验室为基础的淋球菌耐药监测系统，而云南省淋球菌耐药监测工作起步较晚，2018 年才开始在昆明市试点开展该项工作。本文对2018 ～2020 年昆明市淋球菌耐药监测工作中收集的临床分离株进行了药物敏感性检测，对耐药情况进行了分析，为本地淋病临床治疗用药及淋病的防控提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 2018～2020 年在云南省昆明市6 家淋球菌耐药监测哨点收集的422 株淋球菌。所有菌株经鉴定后挑取单菌落，传代一次，洗脱于10%脱脂牛奶中，-70℃保存。标准菌株由中国疾病预防控制中心性病控制中心性病参比实验室提供。

1.1.2 试剂和设备 抗生素：青霉素、环丙沙星、阿奇霉素、头孢曲松、头孢克肟、大观霉素、四环素，由中国疾病预防控制中心性病控制中心性病参比实验室提供。培养基制备原料：GC 基础粉培养基、血红蛋白、生长添加剂Vitox（均来自英国OXOID 公司），无菌脱纤维绵羊血（来自南京便诊公司）。菌悬液浓度测定仪器：分光光度计（Bio Rad）。

1.2 方法

1.2.1 MIC 的测定 采用世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐的琼脂稀释法测定最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）［4］，以WHO P、G、J、L、P 和ATCC49226标准菌株作为质控菌株。各抗菌药物的工作浓度分别为：青霉素和环丙沙星0.015 ～8 mg/L，大观霉素1 ～128 mg/L，阿奇霉素0.03 ～8 mg/L，头孢曲松和头孢克肟0.008 ～1 mg/L，四环素0.5 ～16 mg/L。

1.2.2 结果的判定 参考WHO 西太区淋球菌抗菌药物敏感性判断标准： 青霉素MIC ≤0.06 mg/L 为敏感，0.12 ≤MIC ≤1 mg/L 为中介，MIC ≥2 mg/L 为耐药；环丙沙星MIC ≤0.06 mg/L 为敏感，0.12 ≤MIC ≤0.5 mg/L 为中介，MIC ≥1 mg/L 为耐药；阿奇霉素 MIC ≤0.25 mg/L 为敏感，MIC=0.5 mg/L 为中介，MIC ≥1 mg/L 为耐药；头孢曲松MIC ＜0.125 mg/L 为敏感，MIC ≥0.125 mg/L 为低敏；头孢克肟MIC ＜0.25 mg/L 为敏感，MIC ≥0.25 mg/L 为低敏；大观霉素MIC ≤32 mg/L 为敏感，MIC =64 mg/L 为中介，MIC ≥128 mg/L 为耐药；四环素MIC ≤0.05 mg/L 为敏感，MIC ≥1 mg/L 为耐药，MIC ≥16 mg/L 判定为质粒介导的高度耐四环素淋球菌（Plasmidmediated Tetracycline-resistant Neisseria gonorrhoeae ，TRNG）。

1.2.3 纸片酸度法测定β-内酰胺酶 采用纸片酸度法测定菌株是否产β-内酰胺酶。取pH 8.0 的0.05 mol/L 的磷酸缓冲液100 mL，加入0.2 g 溴甲酚紫，充分溶解混匀后，取10 mL 溴甲酚紫磷酸缓冲液，加入注射用青霉素钠80 万单位。将一接种环培养物涂在滴有上述青霉素溶液的滤纸上，涂膜直径约5mm，室温孵育10min 观察颜色变化。结果判读：变成黄色即为β-内酰胺酶阳性，可判定该菌株为产β-内酰胺酶淋球菌（Penicillinase Producing Neisseria gonorrhoea ，PPNG）；颜色无变化则为阴性，可判定该菌株非产β-内酰胺酶淋珠菌。每次试验以WHO J 标准株作为阳性对照，WHO L 标准株作为阴性对照。

1.2.4 统计分析 使用Excel 2016 对试验结果进行记录和汇总，用SPSS 22.0 进行统计学分析，同一药物3 年间的耐药率、低敏率等计数资料比较采用卡方检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPNG 和TRNG 的检出情况 422 株淋球菌中检出PPNG 282 株（66.82%），TRNG 181 株（42.89%）。2018、2019、2020 年PPNG 检 出 率 分 别 为66.67%（50/75）、68.63%（105/153）、65.46%（127/194），3 年间差异无统计学意义（χ2=0.387，P ＞0.05）。TRNG 检 出 率 分 别 为44.00%（33/75）、46.41%（71/153）、38.46%（80/194），3 年间差异无统计学意义（χ2=1.620，P ＞0.05）。

2.2 淋球菌对7 种药物的敏感性及MIC 分布 2018 ～2020 年分别收集淋球菌75、153 和194 株，合计422株。422 株淋球菌对环丙沙星、四环素、青霉素和阿奇霉素的耐药率分别为99.76%（421/422）、89.81%（379/422）、73.70%（311/422）、10.09%（46/422）。虽然没有统计学差异，但阿奇霉素耐药率有上升的趋势，由2018 年的4%（3/75）上升到2020 年的13.92%（27/194）。对头孢曲松和头孢克肟低敏的菌株分别占5.21%（22/422）和6.64%（28/422），未发现对大观霉素耐药的菌株。422 株淋球菌的耐药率及MIC 值分布情况分别见表1、表2。

表1 422 株淋球菌对7 种药物的敏感情况［n（%）］

表2 422 株淋球菌对7 种抗菌药物的MIC 分布情况（单位：株）

2.3 多重耐药情况 422 株淋球菌中发现了多重耐药情况（同时对2 种及以上抗生素耐药），由于有421株对环丙沙星耐药，1 株对环丙沙星敏感，且该菌株对其他6 种抗生素也均敏感，因此在分析多重耐药情况时采用了3 种及以上的药物组合，分析得到4 种组合模式（表3）。2018 ～2020 年间4 种多重耐药组合模式的耐药率均有所上升，其中环丙沙星+阿奇霉素+四环素这一组合3 年间的差异有统计学意义（χ2=8.047，P ＜0.05），2018 ～2020 年这一组合的耐药率有上升趋势（趋势χ2=6.312，P=0.012）。此外，发现6 株（1.42%）对阿奇霉素耐药，同时对头孢曲松低敏的菌株，2018、2019 年各1 株，2020年4 株，其中2019 和2020 年的5 株还同时对头孢克肟低敏。

表3 422 株淋球菌的多重耐药情况 ［n（%）］

3 讨论

淋球菌对抗菌药物敏感性的降低为淋病的防治工作带来了极大的挑战，而持续的耐药监测对未来淋球菌治疗用药的选择具有重要参考意义。

本研究发现2018 ～2020 昆明市淋球菌对环丙沙星的耐药率已高达99.76%，与国内多地耐药情况相似［5-9］。昆明市淋球菌对四环素的耐药率为89.81%，且3 年间耐药率较为稳定，维持在89.54%～90.67%之间，相比江苏省（100%）和东莞市（95%）要稍低，但TRNG（42.89%）检出率比这两地要高［5，6］，与2018 年浙江省的情况较接近［7］。昆明市淋球菌对青霉素的3 年总耐药率为73.70%，敏感率仅为0.71%，耐药率与江苏省及广东省东莞市的报道接近［5，6］。PPNG 的检出率为66.82%，高于国内多地［5-11］。在云南省昆明市，淋球菌对环丙沙星、青霉素、四环素高度耐药，因此，这些药物已不适用于本地淋病的临床治疗。

阿奇霉素是目前欧美淋病诊疗指南唯一建议使用的口服药物，但目前多个国家发现阿奇霉素的药物敏感性一直在降低［12-16］，而我国阿奇霉素的耐药率也由2008 年之前的2.0%上升到2016 年的20.8%［17，18］。本研究中，2018 ～2020 年阿奇霉素的耐药率分别为4.00%、10.46%、13.92%，有上升的趋势，包括阿奇霉素的多重耐药组合的耐药率均有上升的趋势，特别是“环丙沙星+阿奇霉素+四环素”这一组的上升具有统计学差异。根据WHO 规定，当某种抗菌药物的耐药率＞10%时，应停止使用［7］，因此昆明市已不适合将阿奇霉素单独作为淋病的治疗药物使用。

在本研究中的422 株淋球菌中未发现对大观霉素的耐药菌株。头孢曲松和头孢克肟低敏率均已超过了5%，与广东东莞接近［5］。此外，我国已有部分地区发现淋球菌对头孢曲松和头孢克肟的低敏率在升高［19］，长沙市在2008 之前未发现头孢曲松的低敏菌株，到2015 年低敏率增长到了11.9%［20］，广州市某机构报道2019 年广州市头孢曲松和头孢克肟的低敏率已分别达22%和19%［8］。尽管目前监测数据显示，在昆明市大观霉素、头孢曲松和头孢克肟药物敏感性在90%以上，但在3 年间发现了10 株对头孢曲松MIC ≥0.5mg/L 的菌株，因此要引起重视，并有必要通过分子生物学方法对其基因型别及传播途径进行探究。

淋球菌的多重耐药性受到了较多的关注［6，12，21，22］。虽然本研究分析得到的几种多重耐药组合中的药物已经不作为一线治疗药物，但令人担忧的是发现了6株（1.42%）同时对阿奇霉素耐药且对头孢曲松敏低敏的菌株，其中的5 株还同时对头孢克肟低敏。近年来在荷兰、美国、英国以及我国部分地区都发现了对阿奇霉素耐药同时对头孢曲松低敏的菌株［19，23-26］，中国淋球菌耐药监测系统2013 ～2016 年的监测数据显示，全国范围内对阿奇霉素耐药同时对头孢曲松低敏的淋球菌菌株比例为2.3%，并从2013 年的1.9%上升到2016 年的3.3%［18］，此外，在我国浙江分离到了同时对大观霉素和其他多种抗生素高度耐药的菌株［27］。由于目前多个国家采用阿奇霉素和头孢曲松联合用药的治疗方案，而大观霉素和头孢曲松又是我国推荐的一线治疗药物［28］，多重耐药菌株的发现给国内外淋病治疗方案带来了极大的威胁和挑战。

昆明市2018 ～2020 年淋球菌耐药监测结果显示：422 株淋球菌对青霉素、环丙沙星、四环素的耐药水平极高，对阿奇霉素的耐药率超过10%，这些药物已不适用于本地淋病的临床治疗；422 株淋球菌对大观霉素、头孢曲松和头孢克肟的敏感性较好，这些药物可作为首选治疗药物；此外，出现了阿奇霉素耐药同时对头孢曲松及头孢克肟低敏的菌株，需引起重视。昆明市开展淋球菌耐药监测工作的时间较短，还需持续进行耐药监测，不断扩大耐药监测范围，丰富耐药监测方法，为将来淋病的临床治疗和防控工作提供更加全面、科学的依据。