固相萃取法在蚝油风味物质定量检测中的应用

王泰，TIN Hoe Seng

(1.华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510641；2.华南师范大学 化学与环境学院，广州 510631)

蚝油作为福建、广东两省的传统调味品，现在也深受我国其他地区消费者的喜爱。然而，不同生产厂家的蚝油产品，因原料、生产工艺的差异，其挥发性醛类、醇类、酮类、羧酸类、杂原子化合物等香气成分的含量会发生大幅变化，对蚝油成品的风味造成极大的影响。因此，蚝油风味物质的精确定量检测方法，对蚝油风味质量的定向提升具有重要意义。

传统的样品处理技术经历了液固萃取、液液萃取、固相萃取几个阶段。固相萃取技术适用于大部分食品样品基质的挥发性和半挥发性化合物的萃取[1]，具有消耗溶剂少、重复性好、处理效率高以及样品通量大等特性，方便与高选择性、高灵敏度的检测系统联用[2-3]，因而适用于蚝油风味物质的精确定量检测。随着高灵敏度、高选择性的色谱-单质谱联用仪以及串联质谱仪的快速发展，2003年，美、德两国的科学家共同研发了一种用于蔬菜、水果中痕量农药残留分析的QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)方法，将水溶液中的固体样品加盐后经乙腈萃取，再通过基质分散固相萃取(dispersive-SPE)去除乙腈中存在的大部分干扰物，最后进行检测分析。目前，QuEChERS方法得到了长足的发展，成为检测水果、蔬菜中农药残留的标准样品处理方法。由于蚝油中添加了羟丙基二淀粉磷酸酯、黄原胶、焦糖色等添加剂，基质体系较为复杂，严重干扰特征风味化合物的检测，而由于QuEChERS方法的高灵敏度与高选择性，以及对干扰物良好的去除能力，十分适合用于特征风味化合物的精确定量检测实验中。

Nguyen等[4]对产自中国、泰国和越南的蚝油风味物质的相关研究显示，检出的风味物质主要以醛类、醇类、呋喃类、酯类、含硫化合物、吡嗪类、酮类、芳烃类、羧酸类等化合物为主，类似的化合物在生、熟牡蛎[5]以及牡蛎酶解液[6-7]中也有检出。参照文献中检出的风味物质，选择3-呋喃甲醇、5-甲基-2-乙酰基呋喃、3-(甲硫基)丙醛和2-甲基-2-丁烯醛作为本文的研究物质。这几种风味物质中，呋喃类物质的香味特征性强，多存在于烘烤制品中，与坚果、烤肉、焦糖等香气类似。而醛类物质的气味阈值一般较低，蚝油中的醛类物质可能是亚油酸酯和亚麻酸酯的氢过氧化物降解的产物，提供具有清香、果香和坚果香的芳香特质的气味，其具体风味特征见表1。

表1 蚝油中的风味化合物

本研究通过使用固相萃取方法净化蚝油基质，考察和比较不同净化方法对上述几种风味物质回收率的影响，并形成完整的净化、检测蚝油中风味物质的方法，可以在针对大量蚝油样品的风味物质检测工作中加以应用。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

通过线上电商渠道，购买了6家不同生产厂商出品的6种蚝油，隐去具体生产厂商，仅以编号代称，样品信息见表2。

表2 蚝油样品信息

1.2 试剂耗材

色谱纯甲醇、乙腈、乙酸乙酯等：均购自美国ThermoFisher Scientific公司。

CNW Band HC-C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)、CNW Poly-Sery HLB Pro固相萃取柱(500 mg/6 mL)：上海安谱实验科技股份有限公司；QuEChERS萃取试剂盒(产品编号：5982-5650)、QuEChERS通用分散试剂盒(产品编号：5982-0029)：美国Agilent公司。

标准物质：均购自上海源叶生物科技有限公司。分别用电子天平称取一定量纯品，以甲醇溶解，定容到25 mL容量瓶中。

混合标准溶液的配制：按照标准物质溶液的浓度，用移液枪分别移取一定量的标准物质溶液，混合后用甲醇定容至10 mL，配制成浓度均为100 mg/L的混合标准溶液。

系列标准工作溶液的配制：用甲醇稀释混合标准溶液，配制成浓度分别为0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mg/L的系列标准工作溶液。

1.3 主要仪器与设备

7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；HSE-12B固相萃取装置 天津市恒奥科技发展有限公司；SQP Quintix 125D-1CN电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；Eppendorf 5804R低温高速冷冻离心机 艾本德中国有限公司。

1.4 方法

1.4.1 SPE小柱萃取

蚝油样品的提取：称取2.0 g样品于离心管内，加入20 mL高纯水，涡旋混合均匀，用70 ℃水浴加热10 min，待冷却后，超声提取20 min。离心管在4 ℃、10000 r/min转速下离心15 min，取上清液移入新离心管中待用。

固相萃取柱的活化、上样和洗脱：先用6 mL甲醇活化，再用6 mL水淋洗平衡；吸取10 mL上清液过固相萃取柱上样，以3 mL/min的流速通过填料层。活化和上样过程中应始终保持填料层的湿润。待上样过程完成后，再用10 mL高纯水淋洗填料层，抽干萃取柱内的液体，弃去淋洗液，最后用10 mL乙酸乙酯进行洗脱，收集全部洗脱液。

洗脱液用微弱氮气流吹至近干，用移液枪加入1000 μL乙酸乙酯，重新复溶，过0.22 μm的尼龙滤膜后，进GC/MS，采用SIM模式分析。

1.4.2 QuEChERS法

参考食品安全国家标准GB 23200.113—2018[8]的净化步骤内容进行微调：称取5 g蚝油样品(精确至0.01 g)于50 mL塑料离心管中。加入10 mL乙腈，同时加入Agilent 5982-5650中的盐包1包及陶瓷均质子1颗，盖上离心管盖，剧烈振荡1 min。振荡后，以4200 r/min的转速离心5 min。吸取6 mL上清液加到Agilent 5982-0029中的15 mL塑料离心管中(已经预先加入了硫酸镁、PSA、C18等)，再加入1颗陶瓷均质子，摇匀后涡旋混匀1 min。以4200 r/min的转速离心5 min，吸取1 mL上清液，过0.22 μm有机滤膜，用于GC-MS的测定。

1.4.3 GC/MS条件

色谱柱：DB-WAX熔融石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

气相条件：初始柱温40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率加热到200 ℃，再以10 ℃/min的速率加热到230 ℃，保持3 min，最后以10 ℃/min的速率升至250 ℃并保持3 min。载气He，流速1.2 mL/min，不分流进样。

质谱条件: 离子源温度设置为230 ℃，传输线温度设置为250 ℃，四极杆温度设置为150 ℃，EI离子源，电子能量为70 eV，溶剂延迟设置为4 min。SIM扫描参数见表3。

表3 风味化合物的选择离子扫描参数

2 结果与分析

2.1 标准工作曲线

4种风味化合物的系列标准混合工作溶液浓度范围为0.2～10.0 mg/L，使用GC/MS的选择离子监测模式采集数据，以各化合物系列标准工作溶液的浓度为自变量，以各化合物峰的响应值为因变量，进行回归分析，所得的标准工作曲线见表4。

表4 风味化合物的标准工作曲线

回归曲线的结果表明，对于4种风味化合物而言，使用SIM法扫描采集数据，获取的标准曲线相关系数r大于0.999，线性范围接近两个数量级，可以满足后续分析检测的要求。

2.2 SPE小柱萃取实验

对C18和HLB两种填料的SPE小柱进行净化实验，分别检测蚝油1的空白样及加标样。空白样按照1.4.1所述进行处理，加标样在称量样品之后，分别加入4种风味化合物的标准溶液各1 μL，再依照1.4.1所述进行处理。空白样和加标样重复3个平行样，实验结果见表5。

表5 C18柱空白与加标实验结果比对

HLB固相萃取柱的空白与加标实验结果比对见表6。

表6 HLB柱空白与加标实验结果比对

从C18和HLB两种SPE小柱净化蚝油空白样与加标样的实验结果来看，加标回收率均值的结果低于理论回收率，且RSD值较大。回收率均值低的原因应是前处理过程复杂，且在不同容器之间转移的次数较多；RSD值大意味着实验结果的波动，样品的平行性差，难以将SPE小柱应用于蚝油样品的净化过程。

2.3 QuEChERS萃取实验

对QuEChERS方法的净化实验，仍采用分别检测蚝油空白样及加标样的方法。空白样及加标样的制备方法同2.2所述，实验结果见表7。

表7 QuEChERS前处理空白与加标实验结果比对

由表7可知，QuEChERS前处理方法用于蚝油样品的净化，其稳定性较SPE小柱法好，平行样结果的RSD<15%，说明该净化方法的波动性小。加标回收率实验的结果显示，风味化合物在蚝油样品中的回收率在92%～110%之间，说明该净化方法在回收率指标方面也能够满足后续检测实验的要求。

2.4 蚝油中风味物质的检测

应用2.3中的QuEChERS方法对6种蚝油中的风味化合物进行净化，并上机分析，风味化合物的检测结果见表8。

表8 6种蚝油中风味化合物的检测

由表8可知，在6种蚝油中，各种风味化合物均有检出，其中3-呋喃甲醇的含量在28.2～64.4 ng/g之间，有约2.3倍的差距；5-甲基-2-乙酰基呋喃的含量在18.2～55.7 ng/g之间，有约3.1倍的差距；3-(甲硫基)丙醛的含量在18.7～40.9 ng/g之间，有约2.2倍的差距；2-甲基-2-丁烯醛的含量在27.4～86.9 ng/g之间，有约3.2倍的差距。不同生产厂家的各蚝油中风味化合物的含量、所占比例有较大差别，推测可能是所用原料产地、生产工艺的不同所致。

3 结论

本研究通过比较SPE小柱法与QuEChERS法在净化蚝油基质、检测风味物质的前处理过程中的差别，确定了QuEChERS法是更适合蚝油风味物质检测的前处理方法，结合GC/MS选择离子检测模式采样，检测方法的整体回收率在92%～110%之间，能够满足大量、快速检测的需要。利用该前处理方法，对6种不同生产厂家的市售蚝油样品中的风味化合物进行了检测，结果显示：该研究选择的各风味物质均有检出，含量在18.2～86.9 ng/g之间，浓度差别在2～3倍左右。