卤肉制品中沙门氏菌存活特性分析

许围莹,吴南宛,陈颖琪,符蓉,何欣忆,姚雯,郭亿元,张宏梅

(广东工业大学 生物工程系，广州 510006)

沙门氏菌(Salmonellaspp.)是一类人畜共患病食源性致病菌，其污染事件往往给人类健康和食品加工产业造成严重损失[1-3]。传统的酱卤方法常采用老汤，其在加工和保存的过程中极容易引发沙门氏菌感染[4-5]。较高的杀菌温度虽然能在短时间内杀死绝大多数细菌，但也容易导致食品中蛋白质变性、物质分解、氧化作用加速等问题[6]。为了既保证杀死所有的致病菌，又保留食品的风味与口感，需要寻找合适的加热温度及时间。

目前针对食品的抑菌方式大多采用化学抑制剂，虽然能有效降低食品表面微生物的数量，但同时也影响了产品的色泽与风味，甚至出现化学物残留等可能危害健康的问题。因此，越来越多的研究工作者试图从植物来源中寻找有效抗菌成分。百里酚是从百里香中提取出来的活性成分，已被大量的研究证实能有效抑制沙门氏菌的生长，并有望成为饲料和食品的抗菌添加剂[7-8]。肉桂醛也是常用的植物源天然抑菌剂，其作为防腐剂已被广泛应用于食品工业中，有研究显示肉桂醛对沙门氏菌、大肠杆菌等致病菌有较强的生长抑制性能[9]。但在目前的文献资料中，针对百里酚和肉桂醛在不同储藏温度下对卤汁中肠炎沙门氏菌的抑制效果还鲜有报道。

本研究模拟传统的卤肉制品加工方式，探究经85 ℃热处理、4 ℃或37 ℃贮存下卤肉汁中肠炎沙门氏菌的生长规律，并利用数学模型对存活数值进行拟合。此外，还分析了百里酚和肉桂醛在不同贮存温度下的抑菌效果。本研究为解决酱卤制品加工及保存过程中的安全问题奠定了科学基础。

1 材料和方法

1.1 菌株

肠炎沙门氏菌(SalmonellaenteritidisCICC 21482)：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 材料

新鲜牛肉糜、牛腱子肉：购自上海玺欢厨房旗舰店；草果、红花椒、八角、烟桂皮、丁香：购自广州菜男旗舰店；砂仁粉：购自上海吃嘛嘛香调料总店；陈皮：购自安徽亳州亳诚旗舰店；白蔻：购自四川成都菇豆农食品旗舰店；常用食品调味品：购自天猫超市。

1.3 试剂

缓冲蛋白胨水(BPW)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、琼脂粉(agar powder)：购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；百里酚(thymol)、肉桂醛(cinnamaldehyde，≥95%，色谱纯)：购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；吐温80(Tween 80)：购自天津市大茂化学试剂厂。

1.4 方法

1.4.1 热处理条件下卤肉汁中沙门氏菌的存活情况

1.4.1.1 菌悬液的制备

按1∶300的比例将肠炎沙门氏菌CICC 21482冻存液接种到3 mL TSB培养基中，于37 ℃、180 r/min的摇床中培养24 h。取200 μL菌液涂布于TSA平板上，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。向长满菌苔的平板上滴加2 mL无菌BPW，利用涂布棒将菌膜轻轻刮下至培养皿一侧直至固体培养基呈透明状态。倾斜培养皿，吸取培养皿一侧的所有液体至15 mL无菌离心管中，此时菌液浓度为9～10 log CFU/mL。菌液需现刮现用或放置于4 ℃冰箱内备用(时间不超过1 d)。

1.4.1.2 卤汁的制备

香辛料配方：用电子分析天平称取砂仁粉1 g、香叶0.2 g、豆蔻1 g、八角1 g、陈皮0.7 g、红花椒1 g、丁香0.2 g、烟桂皮0.7 g、草果5 g、白酒2 g、食盐15 g、白糖20 g、酱油25 g[10]。称量后将香辛料转移至塑料密封袋中放置于阴凉处保存。

将香辛料与1 L去离子水混合置于不锈钢锅内，用报纸密封严实，在立式压力蒸汽灭菌器内121 ℃灭菌15 min后冷却至室温，在无菌环境下以每管5 mL分装至离心管内备用。

1.4.1.3 热处理方法

将提前解冻好的牛肉糜在洁净环境下称量，以每管2 g浸入装有5 mL卤汁的离心管内，加入0.1 mL菌液使卤肉汁中沙门氏菌初始浓度为6～7 log CFU/mL。分3份放置于恒温水浴锅内进行85 ℃热处理，处理时间分别为0，5，10，15，20，30，40，50，60 min。达到预定时间点后立即将样品插入冰水中，取1 mL样品进行稀释涂布。

1.4.2 不同储藏温度下卤肉汁中沙门氏菌的存活情况

按1∶300的比例将肠炎沙门氏菌CICC 21482冻存液接种到3 mL TSB培养基中，在37 ℃恒温振摇培养24 h，此时菌液浓度达到8～9 log CFU/mL，用BPW梯度稀释至所需浓度，放置于4 ℃冰箱内备用(时间不超过1 d)。将香辛料放入不锈钢锅内，加入1 L去离子水，再放入400 g牛腱子肉，用报纸密封严实，于121 ℃灭菌15 min后冷却至室温备用。

37 ℃保存：吸取卤肉汁上清液至玻璃试管中，加入适宜浓度的沙门氏菌菌悬液，使卤肉汁中菌的初始浓度达到2～3 log CFU/mL，于37 ℃静置培养，分别于0，4，8，24，36，48，60，72 h取3个平行样，用TSA进行平板计数。

4 ℃保存：吸取卤肉汁上清液至玻璃试管中，加入适宜浓度的沙门氏菌菌悬液，使卤肉汁中菌的初始浓度达到4～5 log CFU/mL，于4 ℃冰箱中静置培养，分别于0，5，10，28 d取3个平行样，用TSA进行平板计数。

1.4.3 百里酚和肉桂醛对4 ℃和37 ℃下卤肉汁中沙门氏菌存活情况的影响

吸取100 μL不同浓度的百里酚水溶液至卤肉汁中使其终浓度分别为0.100，0.200，0.300，0.400，0.500，0.600，0.700，0.800，0.900，1.000 mg/mL，或吸取100 μL不同浓度的肉桂醛水溶液(利用1%吐温80增大其溶解度)至卤肉汁中使其终浓度分别为4.000，2.000，1.000，0.500，0.250，0.125，0.063，0.031 μL/mL。以1∶10的接种比例加入沙门氏菌菌液，将菌浓度调至6～7 log CFU/mL。以卤肉汁和菌悬液的混合液为阳性对照，以卤肉汁和1.000 mg/mL百里酚的混合液或卤肉汁和4.000 μL/mL肉桂醛的混合液为阴性对照，以只加卤肉汁为空白对照。37 ℃振摇培养24 h后观察液体的浑浊度，澄清透明液体中最小药物浓度为百里酚或肉桂醛对卤肉制品中沙门氏菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。取100 μL该澄清液体均匀涂布于TSA平板上，37 ℃静置培养24 h，以培养基上菌落数不超过5个的最小药物浓度为百里酚的最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)。

加入百里酚或肉桂醛抑菌液至装有卤肉汁的玻璃试管中，使其终浓度分别为1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC，同时设置空白对照组(不加百里酚或肉桂醛)。37 ℃保存：以1∶10的接种比例加入菌液使菌初始浓度为4 log CFU/mL，将菌液和含有抑菌剂的卤肉汁涡旋混匀，于37 ℃下培养，分别于0，4，8，24，48 h取样计数。4 ℃保存：以1∶10的接种比例加入菌液使菌浓度为4 log CFU/mL，混合均匀后于4 ℃冰箱中静置培养，分别于0，5，10，28 d取样涂布。

1.5 数据统计与分析

本研究中，每组实验均做3个生物学重复，采用Excel 2019进行数据处理和方差分析，P<0.05表示有显著差异，P<0.01表示有极显著差异。使用Origin 8.5统计软件对数据作图。针对不同贮藏温度下的生长曲线，选取线性或非线性数学模型进行拟合。

2 结果与分析

2.1 热处理条件下卤肉汁中沙门氏菌的存活特性分析

由图1可知，在85 ℃水浴加热环境中，沙门氏菌的存活量随着热处理时间的增加而降低。当热处理时间为5 min时，由初始浓度(6.98±0.24)log CFU/mL减少至(4.60±0.54)log CFU/mL，下降了2.38 log CFU/mL；当热处理时间为10～15 min时，与5 min热处理相比差异不显著(P>0.05)；当热处理时间延长至20～30 min时，沙门氏菌减少了3～5 log CFU/mL；30 min后，菌浓度均低于检测限(1 CFU/mL)。结果表明，85 ℃下热处理时间对卤肉汁中沙门氏菌数量变化有十分显著的影响(P<0.01)，经85 ℃热处理30 min可以基本消灭卤肉汁中的沙门氏菌。Sarjit等[11]研究表明，沙门氏菌在肉汁模拟系统中70 ℃热处理5 min可以减少5.80～7.36 log CFU/mL，热致死作用比本研究明显，这可能是因为本研究的卤肉汁成分与其不同，而不同的食品介质会影响微生物的热耐受性。

图1 85 ℃不同热处理时间对卤肉汁中沙门氏菌存活情况的影响

2.2 不同储藏温度下卤肉汁中沙门氏菌存活动力学分析

2.2.1 4 ℃卤肉汁中沙门氏菌存活情况

由图2可知，在4 ℃储藏温度下，卤肉汁中沙门氏菌存活量随着时间的延长呈缓慢下降趋势。初始菌浓度为(4.83±0.14)log CFU/mL，到了第5天，菌浓度下降至(3.97±0.17)log CFU/mL，下降了约0.86 log CFU/mL；第10天时，菌浓度为(3.51±0.14)log CFU/mL，与初始菌浓度相比下降了约1.32 log CFU/mL；到了第28天，沙门氏菌减少了2.03 log CFU/mL，约为初始浓度的41.9%。通过统计分析得出，在4 ℃条件下，储藏时间对卤肉汁中沙门氏菌数量变化有非常显著的影响(P<0.01)。

图2 4 ℃储藏条件下卤肉汁中沙门氏菌的存活情况

根据图2结果，利用Linear模型、修正的Gompertz模型、Weibull模型、ExpDec1模型对数据进行拟合(见图3和表1)，4种模型的决定系数(R2)分别为0.8371，0.9618，0.9936，0.9988，因此ExpDec1方程的拟合效果最佳。

图3 4 ℃卤肉汁环境中利用Linear模型、修正的Gompertz模型、Weibull模型、ExpDec1模型拟合的沙门氏菌存活动力学曲线图

表1 4 ℃卤肉汁环境中沙门氏菌的存活动力学模型

2.2.2 37 ℃卤肉汁中沙门氏菌存活情况

由图4可知，在0～4 h内，卤肉汁中沙门氏菌增长了0.65 log CFU/mL，4～8 h增长了3.14 log CFU/mL，8～24 h增长了1.71 log CFU/mL。而24～72 h内，菌浓度基本稳定在8～9 log CFU/mL，处于动态平衡阶段，沙门氏菌终浓度约为初始菌浓度的105倍。0～24 h内，储藏时间对沙门氏菌的影响非常显著(P<0.01)。该存活曲线与典型的微生物生长曲线有着较高的相似度，说明卤肉汁环境能够给沙门氏菌提供营养和繁殖的空间，且37 ℃下经过4 h，卤肉制品开始有腐坏风险。该研究结果与刘敏等[12]的报道相似，均表明食品的储藏温度对肠炎沙门氏菌的生长具有较大影响，因此在加工和贮藏环节中维持较低温度对降低卤肉制品中沙门氏菌污染风险具有十分重要的意义。

图4 37 ℃卤肉汁中沙门氏菌的存活情况

采用Logistic模型、SWeibull 2模型对图4中数据进行非线性拟合(见图5和表2)，Logistic模型和SWeibull 2模型的决定系数(R2)分别为0.9993和0.9919。由于Logistic模型的R2值比SWeibull 2模型更接近1，因此Logistic模型的拟合效果最佳，得出37 ℃贮藏温度下卤肉汁环境中沙门氏菌的生长动力学模型为Logistic模型。

图5 37 ℃卤肉汁中利用Logistic模型、SWeibull 2模型拟合的沙门氏菌存活动力学曲线图

表2 37 ℃卤肉汁环境中沙门氏菌的存活动力学模型

2.3 天然防腐剂对卤肉汁中沙门氏菌存活情况的影响

2.3.1 百里酚对卤肉汁中沙门氏菌存活情况的影响

2.3.1.1 卤肉汁中百里酚的MIC及MBC

由表3可知，阳性对照组为浑浊状态，阴性对照组及空白对照组均为澄清状态，这说明卤肉汁能够使沙门氏菌增长且实验环境可靠。百里酚抑菌液使用水浴加热的方法增大溶解度，即使在最大百里酚浓度(1.000 mg/mL)下,溶液依然是澄清状态，不影响MIC的判断。通过对比不同百里酚浓度的卤肉汁浑浊状况，得出卤肉汁中百里酚的MIC值为0.500 mg/mL。从百里酚浓度为0.500 mg/mL的试管内取100 μL均匀涂布于TSA平板上，37 ℃静置培养24 h后，肉眼观察培养基上只有1个菌落(<5个)，故百里酚能够杀灭肠炎沙门氏菌的最小药物浓度MBC为0.500 mg/mL。已有的研究报道结果表明，百里酚具有一定的抑菌活性。如Zhou等[13]以MH肉汤作为培养基，得出鼠伤寒沙门氏菌对百里酚表现出敏感性特征，MIC值为0.400 mg/mL，抑菌能力与本研究结果相似，表明向食品介质中添加一定浓度的百里酚同样能够发挥良好的抑菌效果。

表3 百里酚浓度对卤肉汁中沙门氏菌存活情况的影响

2.3.1.2 4 ℃和37 ℃条件下不同浓度百里酚对沙门氏菌存活情况的影响

由图6可知，在4 ℃条件下，经过28 d，空白对照组(无百里酚)由初始菌浓度(3.43±0.24)log CFU/mL减少至(1.88±0.24)log CFU/mL；当添加了1/8 MIC浓度的百里酚时，菌量于第28 天减少至(2.03±0.83)log CFU/mL；1/4 MIC组和1/2 MIC组分别于第28天和第10 天时低于检测限，而1 MIC组、2 MIC组于第5天时已无菌落生长。通过统计分析得出，百里酚浓度为1/8 MIC和1/4 MIC时对沙门氏菌的抑制作用差异不显著(P=0.95>0.05)。对图6中数据作可重复双因素方差分析，得出4 ℃条件下百里酚浓度对沙门氏菌存活有极显著影响(P<0.01)，储存时间也有极显著作用(P<0.01)，且两者的交互作用影响也十分显著(P<0.01)。

图6 4 ℃下沙门氏菌在百里酚浓度为1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC的卤肉汁环境中的存活情况

由图7可知，在37 ℃条件下，经过4 h的培养，空白对照组由初始菌浓度4.30 log CFU/mL增加至(6.15±0.24)log CFU/mL，8 h后菌浓度增加至(7.32±0.18)log CFU/mL，进入稳定期。与空白对照组相比，百里酚浓度为1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC时无显著差异(P<0.01)，说明百里酚浓度为1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC时对37 ℃卤肉汁中的沙门氏菌没有明显的抑制作用。百里酚浓度为1 MIC、2 MIC时，沙门氏菌在4 h时已低于检测限。对图7中数据进行可重复双因素方差分析，得出37 ℃条件下百里酚浓度及储藏时间均对沙门氏菌生长有非常显著的影响(P<0.01)，二者的交互作用影响也十分显著(P<0.01)。

图7 37 ℃下沙门氏菌在百里酚浓度为1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC的卤肉汁环境中的存活情况

以上结果表明，百里酚的抑菌效果具有浓度依赖性，即当浓度达到1 MIC时，抑菌能力随着浓度的升高而增大。当百里酚浓度≥1 MIC(0.500 mg/mL)时，即可在4 ℃、5 d内和37 ℃、4 h内有效抑制沙门氏菌的生长。

2.3.2 肉桂醛对卤肉汁中沙门氏菌存活的影响

2.3.2.1 卤肉汁中肉桂醛的MIC及MBC值

由表4可知，37 ℃下培养24 h后，阳性对照组和吐温对照组均变浑浊，对两组试管内的液体进行微生物计数。计数结果为：阳性对照组8.49 log CFU/mL，吐温对照组8.64 log CFU/mL，两组沙门氏菌的生长状况无显著差异(P>0.05)，表明1%吐温80对实验菌株没有抑制作用。阴性对照组和空白对照组试管内的液体均澄清，表明初始实验条件可靠，卤肉汁和肉桂醛中均没有存活的沙门氏菌。

表4 肉桂醛浓度对沙门氏菌存活情况的影响

从浑浊情况可以判断，卤肉汁中肉桂醛的MIC值为0.250 μL/mL。但是当肉桂醛浓度升至4.000 μL/mL和2.000 μL/mL时，试管内液体均变浑浊，通过实验验证可知，这种现象同样是由吐温的乳化作用导致，故4.000 μL/mL和2.000 μL/mL的肉桂醛也能抑制沙门氏菌的生长。从肉桂醛浓度为0.250 μL/mL的试管内取100 μL均匀涂布于TSA平板上，37 ℃静置培养24 h后观察培养基上无肉眼可见菌落，故肉桂醛能够杀灭细菌的最小药物浓度MBC为0.250 μL/mL。陈桂柳等[14]的研究得出肉桂醛对游离态鼠伤寒沙门氏菌的MIC为0.40 μL/mL，比本研究的抑菌浓度略高，可能与沙门氏菌血清型不同有关，也可能是卤汁中某种特殊成分与肉桂醛的协同作用致使抑菌浓度略有降低，这有待后续探索与研究。

2.3.2.2 4 ℃和37 ℃条件下不同浓度肉桂醛对沙门氏菌存活情况的影响

由图8可知，经28 d、4 ℃储存，所有实验组均由初始菌浓度(4.70±0.43)log CFU/mL减少至低于检测限。在第5天时，肉桂醛浓度为1 MIC、2 MIC的实验组菌浓度分别降至(2.99±0.48)log CFU/mL和(2.46±0.27)log CFU/mL，2 MIC组在第10天时已经低于检测限。对图8中数据进行可重复双因素方差分析得出，1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC的抑制作用与空白对照组无显著差异(P>0.05)，1 MIC组和2 MIC组有十分明显的抑菌作用(P<0.01)。结果表明，4 ℃条件下1 MIC及1 MIC以上浓度的肉桂醛对沙门氏菌生长有极显著的抑制作用(P<0.01)，储存时间也有极显著的影响(P<0.01)，二者的交互作用也非常显著(P<0.01)，与洪小利等[15]的报道相似。

图8 4 ℃下沙门氏菌在肉桂醛浓度为1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC的卤肉汁环境中的存活情况

由图9可知，在37 ℃条件下，初始菌浓度为(3.24±0.01)log CFU/mL，空白对照组在第8 h时已达到对数后期(接种沙门氏菌后培养8～12 h)，24 h时菌浓度达到(7.93±0.40)log CFU/mL，为稳定期状态。与空白对照组相比，1/8 MIC、1/4 MIC的肉桂醛对卤肉汁环境中的沙门氏菌没有明显的抑制作用(P>0.05)，24 h后菌浓度均增至7～8 log CFU/mL。1/2 MIC浓度在0～4 h表现出十分明显的抑制作用(P<0.01)，4 h时减少至(2.65±0.13)log CFU/mL；但在4～8 h抑制作用减弱，菌浓度呈上升趋势；24～48 h时，菌浓度已达到7～8 log CFU/mL，与空白对照组、1/8 MIC组和1/4 MIC组无显著差异(P>0.05)，分析可能是沙门氏菌对1/2 MIC浓度的肉桂醛逐渐产生了抗性。MIC组在0～4 h时与空白对照组无显著差异(P>0.05)；但培养到第8 h时，沙门氏菌菌量下降至(2.68±0.49)log CFU/mL，减少了约0.5 log CFU/mL；24 h及之后菌落数下降至低于检测限。2 MIC组在0～4 h就发挥了很强的抑制作用(P=0.0007<0.01)，4 h及之后的菌落数均低于检测限。对图9中的数据进行可重复双因素分析，得出37 ℃下MIC及MIC以上浓度的肉桂醛对卤汁中的沙门氏菌有非常显著的抑制作用(P<0.01)，储存时间也有非常显著的影响(P<0.01)，二者的交互作用影响也十分显著(P<0.01)。

图9 37 ℃下沙门氏菌在肉桂醛浓度为1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC的卤肉汁环境中的存活情况

以上结果表明，卤肉汁中肉桂醛的抑菌效果具有浓度依赖性，即当浓度达到1 MIC时，抑菌能力随着浓度的升高而增大。当肉桂醛浓度≥2 MIC(0.500 μL/mL)时即可在4 ℃、10 d内和37 ℃、4 h内有效控制沙门氏菌的生长。

3 结论

传统卤肉制品含有丰富的营养成分且风味独特，深受消费者的青睐。然而，近几年常常因为储藏方式不当或加工工艺等问题而爆发食源性致病菌污染事件。本研究以卤肉汁作为食品基质，探讨了肠炎沙门氏菌经过85 ℃热处理，在不同贮藏温度(4，37 ℃)以及天然防腐剂(百里酚、肉桂醛)等条件作用下的存活特性。结果显示，热处理时间、储藏温度、百里酚和肉桂醛均会对卤肉汁中肠炎沙门氏菌的生长产生重要影响，表明85 ℃热处理30 min、4 ℃低温储藏、添加0.500 mg/mL的百里酚或0.250 μL/mL的肉桂醛均能有效降低卤肉汁污染沙门氏菌的风险，且百里酚或肉桂醛的抑菌效果具有浓度依赖性。同时，在4 ℃或37 ℃条件下卤肉汁中沙门氏菌的存活曲线分别用ExpDec1模型和Logistic模型拟合效果最佳。本研究结果可为传统卤肉制品加工工艺及储藏条件的优化提供理论参考，为保证酱卤制品的安全性生产奠定科学基础。