南宁地区猪场猪等孢球虫病的流行病学调查与分析

颜 勇

(广西职业技术学院农业工程学院，广西 南宁 530226)

猪肠道寄生虫病是养猪业中常见寄生虫病之一，临床中猪的肠道内寄生虫以线虫类和原虫类较常见，肠道寄生虫病主要引起不同阶段猪的厌食、消瘦、腹泻、肠炎等一系列症状，严重者贫血、脱水、生长发育不良等，甚至直接导致动物死亡[1-2]。猪球虫病主要是由等孢球虫和艾美尔球虫等寄生于仔猪小肠上皮细胞内引起的一种多发寄生原虫病，该病呈世界性分布，尤其在集约化猪场、散养猪场更为常见，引起猪球虫病的病原有17种，我国就有13种，其中以等孢球虫感染最为常见[3-4]。猪等孢球虫(Isosporasuis，I.suis)主要引起仔猪的腹泻，主要危害8～15日龄仔猪，感染日龄越小的仔猪病情越严重，死亡率越高，是引起哺乳仔猪患球虫病的主要病原，给养猪业造成严重的经济损失[5-7]。因此，在猪养殖过程中应该引起重视。

本试验于2019—2020年采集南宁地区不同规模化猪场、散养户中不同日龄的患腹泻猪的粪便样品1 319份，采用饱和盐水漂浮法、显微镜观察法和PCR方法进行猪等孢球虫检测，分析其流行情况，为该地区猪场猪等孢球虫病综合防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2018—2020年，采集南宁地区不同规模化猪场、散养户中不同日龄的患腹泻猪的粪便样品1 319份(表1)。

表1 2018—2020年猪场病料采集情况

1.2 主要试剂 粪便DNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒，均购自TaKaRa公司；DL-2 000 Marker、ExTaqDNA聚合酶,均购自宝生物工程(大连)有限公司。显微镜、载玻片、饱和糖-盐水溶液、过滤网等常规仪器及试剂由广西职业技术学院畜牧兽医系动物疾病实验室提供。

1.3 样品采集与处理 采集患腹泻猪的新鲜粪便50～100 g，装入无菌的样品管中，标注样品信息，粪便样品分成2份，置于4 ℃冰箱保存。

1.4 显微镜观察 参照参考文献[8]的方法进行操作。对收集的卵囊进行显微镜观察，显微镜观察到虫卵的粪便样品，用饱和糖-盐水溶液漂浮法收集球虫卵囊，对收集的卵囊液采用饱和糖水溶液漂浮法和梯度离心法进行卵囊纯化，浓集的卵囊置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.5 粪便中基因组DNA提取 显微镜观察到虫卵的粪便样品，参照粪便 DNA 提取试剂盒说明书提取粪便中基因组 DNA，-80 ℃保存备用。

1.6 PCR鉴定与测序 参照参考文献[9]，按GenBank中I.suis18S rRNA 基因全序列(U97523)设计特异性引物(表2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以提取的粪便中基因组DNA为模板，用I.suis18S rRNA引物进行PCR鉴定，回收PCR 产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，与GenBank中登录的参考株进行同源性比对，应用 DNASTAR软件构建系统发育树。

表2 引物信息

1.7 数据统计与处理 统计猪等孢球虫感染阳性数、阳性率、总阳性率，分析其流行情况。阳性率/%=阳性样品数/总样品数×100%；总阳性率/%=总阳性样品数/总样品数×100%。

2 结果

2.1 显微镜观察 采集的样品经过4～5次纯化后得到浓集的球虫卵囊，将浓集的球虫卵囊进行稀释，在显微镜下可以观察到卵囊呈球形或卵圆形，无色或黄褐色，壁光滑且较薄，个别出现孢子化(图1)，与刘光辉等[10]报道的猪等孢球虫形态基本上一致。

图1 猪等孢球虫卵囊显微镜观察(40×)

2.2 猪等孢球虫18S rRNA基因 PCR鉴定与测序 提取采集的1 319份粪便样品的基因组DNA，对I.suis18S rRNA基因进行PCR检测。结果显示，344份扩增出大约为1 178 bp的目的条带，与预期大小一致(图2)。通过序列分析及 BLAST比对，阳性样品与GenBank中I.suis18S rRNA同源性在98%～100%。选择代表株(Isolates株)，应用DNASTAR软件构建系统进化树，与NCBI中登录的猪球虫序列同源性为100%(图3)。

图2 病原的PCR检测结果

图3 I.suis Isolates株的18S rRNA基因进化树分析

2.3 不同年份的猪等孢球虫检测数据统计与分析 对采集的1 319份粪便样品进行I.suis综合检测，结果如表3所示，2018—2020年规模化猪场、散养猪场I.suis阳性率为26.1%，其中规模猪场、散养猪场I.suis阳性率分别为10.0%和15.5%。规模化猪场I.suis阳性率呈现逐年下降的趋势，散养猪场I.suis阳性率呈现逐年上升的趋势。

表3 不同年份的I.suis检测结果

2.4 不同阶段猪感染猪等孢球虫检测数据统计与分析 对采集的1 319份粪便样品进行I.suis综合检测，结果如表4所示，2018—2020年规模化猪场、散养猪场主要以哺乳仔猪、断奶仔猪感染I.suis为主，分别占总样品数的8.6%和7.4%。

表4 不同阶段猪感染I.suis检测结果

3 讨论

国内多项研究表明，猪等孢球虫感染以隐性感染为主，不易诊断，对该病的隐性感染重视不够，在发生疫情以后才进行治疗，猪场中定期对相关寄生虫的检测具有重要意义[10-11]。I.suis多数以隐性感染为主，不会直接造成猪的死亡，但可以导致猪的抵抗力、免疫力下降，引发其他疾病，并形成混合感染，加速猪的死亡，给养殖业造成严重的经济损失[12]。因此，规模化猪场应该注重该病的防控。

猪等孢球虫检测可通过饱和盐水漂浮法、显微镜观察法进行检查，但是容易漏检且时间较长，而PCR检测方法则可以快速检测出是否感染猪等孢球虫，具有一定时效性，被广泛应用[7-8]。本试验通过饱和盐水漂浮法、显微镜观察法和PCR方法对患腹泻猪的1 319份粪便样品进行猪等孢球虫检测。结果显示，2018—2020年I.suis总阳性率为26.1%(344/1 319)，其中规模化猪场I.suis总阳性率为10.0%，呈现逐年下降的趋势，散养猪场猪等孢球虫总阳性率为15.5%，呈现逐年上升的趋势。说明南宁地区Isosporasuis在规模化猪场、散养猪场中流行，且散养猪场阳性率高于规模化猪场，说明散养猪场对该病的防控意识有待提高。规模化猪场、散养猪场主要以哺乳仔猪、断奶仔猪感染猪等孢球虫为主，说明该病主要危害哺乳仔猪、断奶仔猪，应该注意定期给哺乳仔猪、断奶仔猪进行合理的驱虫，同时注意环境卫生及消毒，进行综合防控。本调查与郭建超等[4]、蓝养金[5]、盛祖勋等[8]报道的猪等孢球虫流行情况有一定的差异性，可能与地区、养殖环境和综合防控有关。本调查为南宁地区猪场猪等孢球虫病防控提供参考依据。