猪链球菌组氨酸三联体蛋白多抗的制备及Dot-ELISA检测方法的建立

蔡旭燊,燕书豪,赵芷若,郑 峰，胡 丹，卢亚维,申雪娇,何 铠,熊晓辉,操 敏,卢一辰

猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一种人兽共患病病原体[1]。猪链球菌根据荚膜多糖抗原特异性的不同，可分为 35 个血清型，其中猪链球菌2型(Streptococcussuis2,S.suis2)在全世界范围内分布最广、致病性最强[2]。感染S.suis2可引起脑膜炎、败血症、急性死亡等严重病症，我国曾在江苏、四川两地暴发过大规模感染S.suis2的疫情，不仅导致了大量生猪的死亡，还分别造成了 25 人感染14 人死亡和 204 人感染 38 人死亡的严重后果[3-4]。其它血清型的分布有明显的地理差异[5]，英国最流行的血清型是1型和14型。而血清型 9型在澳大利亚、德国、比利时等国家最为流行[6]，血清型 3 型在泰国、韩国等亚洲国家最为常见[7-8]。人感染猪链球菌疫情的反复密集暴发引起了人们的高度关注，及时的诊断和发现S.suis感染，是防控人感染猪链球菌疫情的重要措施。因此，针对猪链球菌检测方法的研究具有重要意义。

目前，猪链球菌的检测方法主要包括病原学检测、核酸检测和免疫学检测[9]。传统病原学检测的过程主要包括猪链球菌的分离和鉴定，该过程繁杂耗时且灵敏度不高。核酸检测方法包括普通 PCR[10-11]、多重 PCR[12]、荧光定量 PCR[13]、环介导等温扩增[14]、基因芯片[15]、脉冲场凝胶电泳[16]等方法。核酸检测方法灵敏度高，但对设备和人员的要求较高，在偏远地区不宜广泛开展。免疫学检测方法利用抗原和抗体之间高度特异性结合的原理，包括酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫层析法(Immunochromat-ographic assay,ICA)和斑点酶联免疫吸附法(Dot enzyme-linked immunosorbent assay, Dot-ELISA)。免疫学检测方法操作简单，不需要任何复杂的设备仪器，适合大规模现场诊断[17]。Yang等[18]研制了一种免疫层析试纸条，用于检测S.suis抗体。该方法具有良好的敏感性和特异性，然而这种方法不是直接检测抗原，不能较早的检测到S.suis感染。目前，建立一种简便、快速、经济的S.suis检测方法是畜牧业和科学研究亟待解决的问题[19]。

组氨酸三联体蛋白(Histidine triad protein,HTP)是一组膜表面蛋白，广泛分布于多种链球菌中，根据其结构域组成不同可以分为 HTP Ⅰ 和HTP Ⅱ 两个亚型[20]。与 HTP Ⅰ 型蛋白相比，大多数 HTP Ⅱ 型蛋白在末端含有一个富含亮氨酸的重复序列(Leucine-rich repeat,LRR)结构域，这表明 HTP Ⅱ 型蛋白在链球菌感染中可能起到粘附因子的作用[21]。Shao等[22-23]在S.suis2强毒株05ZYH33中鉴定了3个HTP基因(ORF编号SSU0332、SSU1267和SSU1577)，将它们分别命名为 HtpsA、HtpsB和HtpsC。其中 HtpsC 是唯一一个包含 LRR 结构域的蛋白。Li 等[24]研究发现 HtpsC 蛋白能够与人细胞外基质的两种不同组分(层粘连蛋白和纤维连接蛋白)结合，表明 HtpsC 蛋白是一种新型的粘附素。Lu 等[25]发现 HtpsC在结构上与单增李斯特菌毒力因子内化素 A(Internalin A,InlA)相似，进一步研究表明，HtpsC 蛋白参与了S.suis2侵袭宿主上皮细胞的过程，是与细胞粘附和侵袭有关的重要毒力因子。我们将 HtpsC 蛋白氨基酸序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上做 BLAST 分析，结果显示该蛋白广泛存在于S.suis多种株型中，且相似性高。Shao 等[22]的研究发现，35 种不同血清型S.suis的标准株中，29种都含有 HtpsC 蛋白基因。另外，HtpsC 蛋白是暴露于S.suis表面的毒力因子，因此，该蛋白可作为抗原建立一种通用的检测方法。

本研究通过原核表达制备了S.suis2强毒株 05ZYH33 的 HtpsC 蛋白，然后经过动物免疫试验获得了可特异性识别 HtpsC 蛋白的多克隆抗体 Anti-HtpsC，基于制备的 Anti-HtpsC 多克隆抗体建立了S.suis的 Dot-ELISA 检测方法，并对方法中的 Anti-HtpsC 的工作浓度以及酶标二抗的稀释倍数进行了优化，为快速检测S.suis提供了思路和方法。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒来源S.suis2强毒株 05ZYH33 分离自 2005 年四川资阳中毒性休克症病人[26]。S.suis2(NCTC 10234)和S.suis1(5428)、S.suis4(2524)、S.suis7(8074)、S.suis9(22083)、S.suis14(13730)标准株由加拿大 Marecelo Gottschalk 教授惠赠。S.suis2(T15)来自荷兰 Greeff 实验室，由Astrid de Greeff惠赠。S.suis2(WZ48-1)由陆军军医大学李明老师惠赠。大肠杆菌 GDMCC 801268 (Escherichiacoli)、沙门氏菌 GDMCC 801304(Salmonella)、金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26305(Staphylococcusaureus)、单增李斯特菌ATCC 19115(isteriamonocytegenes)、化脓性链球菌ATCC 19615(Streptococcuspyogenes)、无乳链球菌GDMCC 1.408(Streptococcusagalactiae)、粪肠球菌 ATCC 51299(Enterococcusfacealis)购自广东省微生物菌种保藏中心。BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。pET-30a 质粒由本课题组鉴定和保存。

1.2 主要试剂 5 K DNA Marker、硫酸卡那霉素购于生工生物工程(上海)股份有限公司；NdeI和Hind III购于美国 NEB 公司；PAGE 凝胶快速制备试剂盒(10%)、双色预染蛋白Marker(15 ～150 kDa)、ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF 膜 0.45 μm)购于上海雅酶生物医药科技有限公司；Ni-NTA Agarose 购于德国QIAGEN公司；琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、质粒小提中量试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；2×PrimeSTAR mix Premix 购于宝日医生物技术(北京)有限公司；硝酸纤维素膜(NC 膜，货号：abs959)购于爱必信(上海)生物科技有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔 lgG(H+L)(货号：bs-40295G-HRP)购于北京博奥森生物技术有限公司；HRP-DAB 底物显色试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司(货号：PA110)，THB培养基、LB肉汤培养基、BHI培养基购于海博生物技术有限公司。

1.3 HtpsC 蛋白的制备

1.3.1 表达菌株的构建 根据 pET-30a 质粒多克隆位点分析，选择NdeI和Hind III 作为插入位点。使用NdeI和Hind III内切酶将 pET-30a 载体切线性化。根据S.suis2强毒株 05ZYH33 的 HtpsC 蛋白基因序列(GenBank: CP000407.1)设计特异性引物，引物序列如表1所示。以菌液为模板扩增目的基因，使用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒纯化目的片段。使用 ClonExpress II One Step Cloning Kit 试剂盒将目的片段和线性化载体进行无缝克隆连接获得重组质粒(pET-30a-HtpsC)。将构建好的重组质粒转入 BL21(DE3)感受态细胞获得表达菌株。表达菌株通过质粒提取、测序进行验证。

表1 HtpsC基因扩增引物Tab.1 Primers for the HtpsC gene

1.3.2 HtpsC 蛋白的诱导表达 将表达菌株接种于含有卡纳抗性(终浓度为 50 μg/mL)的 LB 培养基，在 37 ℃、180 r/min 培养至OD600=0.8，然后加终浓度为 0.2 mmol/L的IPTG，在15 ℃诱导16 h后收集菌体。离心后使用 PBS 重悬菌体，超声破碎后离心分离上清和沉淀，分别加入 SDS-PAGE 电泳上样缓冲液并煮沸10 min，然后进行 SDS-PAGE 电泳分析。

1.3.3 HtpsC 蛋白的纯化 扩大培养体积并在15 ℃条件下诱导表达16 h 后收集菌体，然后全菌采用 50 mmol/L Tris(pH8.0)，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L Imidazole含1% Triton X-100，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF 超声裂解，同时以50 mmol/L Tris(pH8.0)，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L Imidazole缓冲液平衡 Ni-IDA 亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白并收集。将收集的HtpsC蛋白透析至1×PBS中，并在透析结束后使用0.22 μm滤器过滤，检测蛋白浓度后分装，冻藏于-80 ℃。

1.3.4 Western blot验证HtpsC蛋白 纯化的HtpsC蛋白经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)后，使用Western blot方法进一步验证。具体操作如下：将蛋白凝胶经PBST缓冲液(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS，pH7.4)润洗3 min。将PVDF膜放入甲醇中浸润活化15 s，然后将蛋白凝胶与PVDF膜在转膜缓冲液中平衡10 min。将蛋白凝胶紧贴PVDF膜后，装入转膜夹并放入转印槽中，在冰浴条件下300 mA恒流转膜120 min。转印结束后，将PVDF膜放于封闭液(含5%脱脂奶粉、0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS，pH7.4)中室温封闭1 h。PBST洗涤3次后，加入鼠抗His标签单克隆抗体(1∶3 000稀释)，室温孵育1 h。再次用PBST洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶3 000稀释)，室温孵育1 h。使用PBST洗涤3次后，加HRP-DAB底物显色液，避光反应10 min，然后观察显色。

1.3.5 ELISA验证HtpsC蛋白 以HtpsC蛋白作为抗原，0.05 mol/L碳酸盐缓冲液按10 μg/mL、100 μL/孔4 ℃过夜包被，次日使用PBST洗涤3次。每孔加200 μL封闭液，37 ℃封闭1 h。PBST洗涤3次后每孔加100 μL稀释200倍的感染猪链球菌的猪血清，用正常猪血清稀释200倍做阴性对照，37 ℃孵育1 h。用PBST洗涤3次后，每孔加100 μL兔抗猪IgG(1∶2 000稀释)，37 ℃孵育1 h。然后用PBST洗涤4次，每孔加100 μL TMB显色液避光反应10 min。每孔加2 mol/L硫酸100 μL终止反应，用酶标仪在450 nm波长条件下测定OD值。

1.4 Anti-HtpsC多克隆抗体的制备

1.4.1 动物免疫 将2只新西兰白兔(2～2.5 kg)编号A、B，饲养观察3 d，耳缘采血2 mL作为阴性血清。以纯化的HtpsC蛋白作为抗原，皮下免疫2只新西兰白兔，初免剂量为300 μg/只，二免、三免、四免剂量为150 μg/只，2周免疫1次。免疫4次后采血，收集血清。

1.4.2 间接ELISA方法测定多抗血清效价 以HtpsC蛋白作为抗原，用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液按6 μg/mL、100 μL/孔4 ℃过夜包被，次日使用PBST洗涤3次。每孔加200 μL封闭液，37 ℃封闭2 h。PBST洗涤3次后每孔加100 μL稀释的兔血清(依次稀释1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128 000倍)，用阴性血清稀释1 000倍做阴性对照，37 ℃孵育1 h。用PBST洗涤3次后，每孔加100 μL山羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)，37 ℃孵育1 h。然后用PBST洗涤4次，每孔加100 μL TMB显色液避光反应10 min。每孔加2 mol/L硫酸100 μL终止反应，用酶标仪在450 nm波长条件下测定OD值。

1.4.3 Western blot验证Anti-HtpsC多克隆抗体 将收集的多抗血清通过亲和层析纯化得到Anti-HtpsC多克隆抗体，然后进行抗原Western blot检测。具体操作如下：取纯化的HtpsC蛋白进行SDS-PAGE电泳(HtpsC蛋白上样量为20 ng)。然后转印至PVDF膜上，清洗后室温封闭1 h。清洗3次后加入Anti-HtpsC多克隆抗体(1∶2 000)，室温孵育1 h。清洗3次，然后加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)，室温孵育1 h。清洗3次后，加HRP-DAB底物显色液，避光反应10 min，然后观察显色。

1.5 Dot-ELISA检测方法的建立 将S.suis接种于THB培养基中，160 r/min、37 ℃条件下过夜培养。将NC膜裁剪成1×1 cm2大小的方格置于24孔板中。取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，8 000 r/min离心5 min，吸弃上清，加1 mL无菌1×PBS缓冲液重悬，100 ℃煮沸10 min后作为抗原。向NC膜中央滴加2 μL抗原，37 ℃干燥15 min。加500 μL封闭液，37 ℃振荡封闭2 h。然后用PBST振荡洗涤3次，每次5 min。多克隆抗体使用封闭液进行稀释并加入到24孔板中，每孔200 μL，37 ℃振荡孵育1 h。孵育结束后用PBST清洗3次。每孔加200 μL稀释到工作浓度的HRP标记山羊抗兔IgG，37 ℃振荡孵育1 h。PBST清洗4次后，吸去多余水分，每孔加20 μL DAB显色液，避光反应10 min。反应结束后，蒸馏水清洗4次并吸干。膜上呈黄褐色斑点的即为阳性，反之为阴性。

1.6 Dot-ELISA 检测方法条件的优化

1.6.1 最佳Anti-HtpsC多抗使用浓度的确定 封闭结束后，将Anti-HtpsC按照1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600稀释，按1.5操作流程进行后续操作，根据显色结果选择最佳Anti-HtpsC多抗使用浓度。试验重复3次。

1.6.2 最佳酶标二抗稀释倍数的确定 在确定的最佳Anti-HtpsC多抗使用浓度下，将HRP标记山羊抗鼠IgG以1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000进行稀释，按1.5操作流程进行后续操作，根据显色结果确定最佳酶标二抗稀释倍数。试验重复3次。

1.7 灵敏度试验 将S.suis稀释至1×108CFU/mL、1×107CFU/mL、1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL，100 ℃煮沸10 min后作为抗原，以无菌1×PBS溶液做空白对照，分别滴加2 μL于NC膜中央。在确定的最佳方法上进行后续操作，根据NC膜上是否出现明显黄褐色斑点确定本方法的检测限。试验重复3次。

1.8 特异性试验 使用大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、粪肠球菌作为阴性对照。将9株S.suis(4株血清型为2型，血清型为1、4、7、9、14型各1株)同上述阴性对照菌株培养至1×106CFU/mL，煮沸后作为抗原。以无菌1×PBS溶液作为空白对照，分别滴加2 μL于NC膜中央。在确定的最佳方法上进行后续操作，根据NC膜上是否出现明显黄褐色斑点检测本方法的特异性。试验重复3次。

2 结 果

2.1 HtpsC氨基酸序列比对 将HtpsC蛋白的氨基酸序列同Slr(GenBank: HQ908654.1)、Blr(GenBank: DQ242614.1)、InlA(GenBank: ABO32426.1)的氨基酸序列进行比对。结果如图1所示，发现HtpsC蛋白氨基酸序列与Slr和Blr的氨基酸序列相似性较高，分别为37.23%和37.07%；和InlA的相似性为 27.32%。

2.2 HtpsC蛋白的表达和纯化 IPTG诱导表达的重组菌体经超声破碎后，上清和沉淀分别用10% SDS-PAGE电泳分析。在113 kDa附近可见明显的HtpsC蛋白条带，且重组蛋白主要以可溶性蛋白形式存在(图2)。离心去除超声破碎后的菌体沉淀，对上清进行亲和层析纯化。经300 mmol/L咪唑多次洗脱后，几乎没有杂蛋白的存在，蛋白纯度大于90%。收集纯度较高的HtpsC蛋白，然后透析至1×PBS中，分装后冻存于-80 ℃冰箱。

2.3 HtpsC蛋白的Western blot/ELISA验证 使用His标签抗体作为检测抗体，对纯化后的HtpsC蛋白进行Western blot分析，结果如图3所示：纯化的HtpsC蛋白能够被His标签抗体特异性识别。使用感染猪链球菌的猪血清以及正常猪血清对制备的HtpsC蛋白进行ELISA验证分析，感染猪链球菌的猪血清均大于正常猪血清OD450数值的2.1倍。综上所述，通过原核表达及亲和层析纯化成功制备了HtpsC蛋白(表2)。

表2 ELISA 验证HtpsC蛋白Tab.2 Identification of HtpsC protein by indirect ELISA

2.4 Anti-HtpsC效价检测及Western blot分析 动物免疫试验后收集多抗血清并使用间接ELISA法测定收集的血清中Anti-HtpsC的效价。4次免疫后，两只试验兔收集的多抗血清效价均大于1∶128 000。将多抗血清经亲和层析纯化，分装冻存于-80 ℃冰箱。使用HtpsC蛋白作为检测抗原对Anti-HtpsC多克隆抗体进行Western blot分析，结果如图4所示：制备的Anti-HtpsC多克隆抗体可特异性识别HtpsC蛋白(表3)。

2.5 最佳多抗工作浓度 Anti-HtpsC多抗工作浓度优化结果如图5所示，背景颜色干扰较小，且多抗稀释小于400倍时(图5A-D)斑点清晰。稀释倍数大于400时斑点颜色变淡(图5E-F)。因此选择多抗的最佳稀释倍数为1∶400，此时Anti-HtpsC多抗工作浓度为2.5 μg/mL。

2.6 最佳酶标二抗稀释倍数 在确定的最佳多抗工作浓度条件下进行酶标二抗稀释倍数的优化，结果如图 6 所示：酶标二抗稀释1∶3 000时斑点仍然清晰可见(图 6 C)。稀释倍数大于1∶3 000后斑点颜色减淡。因此选择最佳的酶标二抗稀释倍数为1∶3 000。

2.7 灵敏度、特异性试验 灵敏度检测结果如图7所示：当S.suis浓度大于1×107CFU/mL时，斑点清晰可见；当浓度为1×106CFU/mL时，斑点颜色较浅；当浓度小于1×105CFU/mL时，几乎无斑点显现。灵敏度试验表明，该方法可检测到的S.suis为1×106CFU/mL。特异性检测结果如图8所示：4株S.suis2(图8A-D)以及血清型为1、4、7、14型的S.suis标准株，斑点清晰明显，而S.suis9标准株因为不含有HtpsC蛋白基因[22]，所以未见明显的黄褐色斑点(图8H)。其它对照菌均没有斑点出现，表明该方法的特异性较好。

3 讨 论

在过去的几十年里，免疫分析已经成为实验室中最普遍使用的检测细菌或者病毒的免疫学检测方法[27]。其中 Dot-ELISA 方法是一种可以在一次试验中筛选大量样本的同时，检测抗原或者抗体的快速且简便的试验方法[28]。Attia 等[29]的研究表明，与间接ELISA方法相比，Dot-ELISA方法具有更高的敏感性和特异性。周俊明等[30]建立了针对S.suis2溶菌酶释放蛋白抗体间接 ELISA 检测方法。朱剑等[31]制备了S.suis2分泌核酸酶(SsnA)，并建立了间接 ELISA 检测方法用于检测血清中抗体。Xia等[32]以谷氨酸脱氢酶为诊断抗原建立了猪链球菌间接 Dot-PPA-ELISA 快速特异性检测方法，与常规平板 ELISA 试剂盒进行比较分析，该方法的的特异性和敏感性分别为 97.5% 和 96.6%。然而上述方法的检测对象均为抗体，不能较早的检测到S.suis感染。欧瑜等[33]利用S.suis2分离株 HA9801 毒力相关蛋白溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)构建了 Dot-ELISA 方法和间接 ELISA 方法用于检测猪链球菌，两种方法的阳性率均为 61%，但没有给出明确的检测限。

由于资源有限，我们选择了几种主要致病血清型的S.suis(包括4株S.suis2型菌株以及血清型为1、4、7、9、14 型的S.suis标准株)进行了检测。结果显示，该方法能检出血清型为1、2、4、7、14型的S.suis，而不含有 HtpsC 蛋白基因的S.suis9型没有被检出。虽然我们没有获得所有血清型的猪链球菌用于验证，但基于实验结果，我们可以推测该方法可以适用于含有 HtpsC 蛋白基因的多种血清型S.suis的检测，而不适用于一些不含有 HtpsC 蛋白基因的S.suis(包括血清型为9、12、20、29、32以及33型)的检测。在不含HtpsC 蛋白基因的S.suis血清型中，仅血清型 9 型有致病性报道，因此在血清型 9 型比较流行的澳大利亚、德国以及北美洲地区[6]，该方法需要结合其它S.suis检测方法一起使用。氨基酸序列比对结果显示，S.suis的 HtpsC 蛋白和链球菌属中的化脓性链球菌 Slr、无乳链球菌 Blr 存在较高的相似性，因此我们选择这两种链球菌以及常见致病菌中的粪肠球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌作为对照菌株进行特异性实验。实验结果表明，所建立的 Dot-ELISA方法具有良好的特异性，因此该方法可以满足S.suis的初步检测。

综上所述，本研究利用原核表达制备了 HtpsC 蛋白，并制备了 Anti-HtpsC 多克隆抗体。基于 Anti-HtpsC 多克隆抗体，我们建立了能够直接检测S.suis的 Dot-ELISA 检测方法。在优化的试验方案下，背景清晰、斑点明显。由于试验条件的限制，没有充足的临床实际样本，因此本方法的临床应用表现还有待检验。该方法可以通过直接观察 NC 膜上是否有黄褐色斑点得到试验结果，具有操作简单、方便快捷等特点，适用于在基层、乡镇偏远地区开展S.suis的初步检测。本方法检测灵敏度可达 1×106CFU/mL，和化脓性链球菌、无乳链球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应，特异性好。

利益冲突：无

引用本文格式：蔡旭燊,燕书豪,赵芷若，等. 猪链球菌组氨酸三联体蛋白多抗的制备及Dot-ELISA检测方法的建立[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(8)：657-665. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.104