应用于结核性胸膜炎分子生物学检测的胸腔积液核酸提取方法初步比较分析

杜博平，李自慧，潘丽萍，孙 琦，吕翎娜，朱传智，邢爱英，贾红彦，张宗德

结核病(Tuberculosis，TB)在新型冠状病毒大流行之前是单一传染源导致死亡的首要原因[1]。结核性胸膜炎(tuberculous pleurisy)是一种常见的结核病类型，其发病率在TB非流行地区为3%～5%，在艾滋病病毒感染比例高的TB流行地区可达30%[2]。结核性胸膜炎可引起胸膜增厚、结核性脓胸、乳糜胸、气胸等并发症，导致肺功能损害、慢性胸痛或呼吸困难，对患者造成极大伤害[3-4]。

早期诊断和及时治疗对于减轻结核性胸膜炎并发症和改善预后至关重要，但其诊断目前仍十分困难。结核性胸膜炎的确诊方法包括：胸腔积液结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)病原学阳性(包括涂片、培养或分子生物学阳性)，或胸膜病理符合TB组织病理改变[5]。但胸膜穿刺活检创伤性较大，不适宜作为常规诊断方法，涂片和培养也因胸腔积液中M.tb数量少而检出率非常低(分别<10%和<30%)[6-8]。胸腔积液M.tb分子生物学检测可适当提高结核性胸膜炎的确诊率。例如，世界卫生组织推荐的Xpert MTB/RIF(Xpert)和Xpert Ultra用于结核性胸膜炎诊断的敏感性分别为19%和44%[7]；胸腔积液游离核酸检测诊断结核性胸膜炎的敏感性可达75%[9]。但不同的胸腔积液核酸提取方法对于M.tb核酸检测的影响，如何富集胸腔积液中M.tb核酸以提高检出率等，目前尚报道较少。

本研究采用6种方法提取胸腔积液样本中的核酸，用高灵敏的微滴数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测样本中M.tb特异性核酸的数量，旨在找到有助于分子生物学检测的胸腔积液核酸提取方法，为提高结核性胸膜炎的病原学诊断效率提供指导。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集18例就诊于首都医科大学附属北京胸科医院的结核性胸膜炎患者胸腔积液样本。结核性胸膜炎诊断依据《肺结核诊断WS288-2017》，包括临床诊断病例和确诊病例。患者平均年龄55岁，年龄分布17～89岁，其中男性13例，女性5例。本课题已通过首都医科大学附属北京胸科医院伦理委员会批准。

1.2 胸腔积液核酸提取方法 取出冻存于-80 ℃的胸腔积液样本，室温解冻，每份胸腔积液按照图1所示，分别采用6种方法提取核酸。

1.2.1 游离核酸提取(柱法) 将样本室温16 000 g离心10 min，吸取4 mL上清，采用循环核酸提取试剂盒(Qiagen，55114)提取核酸，采用QIAvac 24 Plus真空装置(Qiagen，19413)辅助，按照说明书步骤进行，最后用50 μL AVE液体洗脱。

1.2.2 离心沉渣核酸提取(物理破碎) 将上面离心后的沉渣用350 μL 1×TE缓冲液重悬，全部转移至含0.1 mm硅珠的裂解管(MP，116911100)中，放于振荡仪(MP，FastPrep-24)中振荡破碎2次，每次参数设置为6.5 m/s×35 s。之后13 000 g离心10 min，吸取上清，采用细菌DNA提取试剂盒(Omega，D3350)继续进行核酸提取，略过溶菌酶裂解步骤，直接加入试剂盒中BTL液和蛋白酶K，后续按照说明书进行，最后用50 μL洗脱液洗脱。

1.2.3 游离核酸提取(磁珠法) 将样本室温16 000 g离心10 min，吸取4 mL上清，采用磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(天根，DP710)提取核酸，按照4 mL上清、6 mL 裂解液、0.4 mL蛋白酶K、60 μL磁珠E和1 μL carrier RNA(1 μg/μL)比例涡旋混匀，其余按说明书进行，最后用50 μL TBC洗脱液洗脱。

1.2.4 离心沉渣核酸提取(化学破碎) 将上面离心后的沉渣用1×TE缓冲液洗涤1次，然后用100 μL 1×TE缓冲液重悬，采用细菌DNA提取试剂盒(Omega，D3350)进行核酸提取。样本中加入20 μL溶菌酶，37 ℃金属浴振荡1 h，期间彻底混匀5次，后续按照说明书进行，最后用50 μL洗脱液洗脱。

1.2.5 胸腔积液核酸直接提取(柱法) 直接吸取700 μL胸腔积液，按照DNA提取试剂盒(Qiagen，51106)说明书步骤提取DNA，按比例加大蛋白酶K、AL裂解液和无水乙醇体积，每个样本上样1个柱子，最后用50 μL AE液洗脱。

1.2.6 胸腔积液核酸直接提取(磁珠法) 直接吸取700 μL胸腔积液，按照磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒(天根，DP329)说明书进行提取，最后用50 μL TB液进行洗脱。

1.3 微滴数字PCR分析M.tb特异的插入序列(insertion sequence，IS)IS6110及IS1081的引物序列、探针序列及探针修饰参照前期工作[10-11]，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和修饰。每20 μL反应体系包括ddPCR supermix for probes(Bio-rad，1863010)10 μL，IS6110和IS1081正、反义引物各0.9 μmol/L，IS6110和IS1081探针各0.2 μmol/L，DNA样本5.6 μL。每个样本设置2个复孔。每次实验均设置无模板对照和阳性对照。将配制好的反应液转移至微滴发生卡(Bio-rad，1864008)样本孔，油孔加入70 μL微滴发生油(Bio-rad，1863005)，盖上胶垫，转移至微滴发生器(Bio-rad，QX200)生成微滴。之后将生成的微滴转移至96孔板，热封后PCR扩增，扩增程序为95 ℃ 10 min，40个循环(94 ℃ 30 s，54 ℃ 40 s)，98 ℃ 10 min。之后将96孔板放于微滴读取仪(Bio-rad，QX200)，使用FAM/HEX双通道读取荧光。用QuantaSoft软件(1.7.4.0917版)分析每20 μL反应体系中的靶标基因拷贝数，拷贝数取复孔平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。非正态分布计量资料两组间比较采用Wilcoxon 配对检验，一致性分析采用Spearman相关性检验，以P<0.05为差异有统计学意义。绘图采用Graphpad Prism 5软件。

2 结 果

2.1 胸腔积液离心上清游离核酸提取——柱法和磁珠法比较 采用柱法(1法)和磁珠法(3法)分别提取相同体积胸腔积液离心上清中的游离核酸。检测结果显示，两种方法提取的核酸样本中M.tbIS6110和IS1081数量无统计学差异[中位数(最小值，最大值)，IS6110，16.9(0.0，698.0)比49.5(0.0，1 216.0)拷贝/20 μL反应体系，Z=-1.501，P=0.133；IS1081，7.1(0.0，224.0)比9.3(0.0，257.0)拷贝/20 μL反应体系，Z=-1.476，P=0.140](图2)。

2.2 胸腔积液离心沉渣核酸提取——物理破碎和化学破碎比较 物理法和化学法是破碎裂解M.tb以释放DNA的两种主要方法，本研究在提取胸腔积液离心沉渣核酸时，主要比较这两种方法。结果表明，提取相同体积胸腔积液离心后的沉渣，采用物理破碎提取的核酸样本中M.tbIS6110和IS1081数量显著高于化学破碎[IS6110，9.7(0.0，639.0)比0.0(0.0，1.0)拷贝/20 μL反应体系，Z=-3.408，P=0.001；IS1081，4.8(0.0，155.0)比0.0(0.0，1.0)拷贝/20 μL反应体系，Z=-3.297，P=0.001]，后者提取的样本中几乎检测不到靶标核酸(图3)。

2.3 胸腔积液原液直接核酸提取——柱法和磁珠法比较 分别采用柱法和磁珠法直接提取相同体积胸腔积液的核酸，结果显示，两种方法提取的样本中检测到的M.tbIS6110和IS1081数量无统计学差异[IS6110，2.5(0.0，25.0)比0.5(0.0，250.0)拷贝/20 μL反应体系，Z=-0.408，P=0.683；IS1081，0.4(0.0，13.0)比0.0(0.0，59.0)拷贝/20 μL反应体系，Z=-0.612，P=0.541](图4)。

2.4 胸腔积液原液核酸直接提取、胸腔积液离心上清游离核酸提取和离心沉渣核酸提取3种方法的比较 根据以上结果，将分别代表胸腔积液离心上清游离核酸提取、胸腔积液离心沉渣核酸提取和胸腔积液原液直接核酸提取的1法、2法和5法比较。结果显示，1法和2法提取核酸样本中的靶标数量无明显差别[IS6110，16.9(0.0，698.0)比9.7(0.0，639.0)拷贝/20 μL反应体系，Z=-1.633，P=0.102；IS1081，7.1(0.0，224.0)比4.8(0.0，155.0)拷贝/20 μL反应体系，Z=-1.371，P=0.171]，1法提取核酸样本中的靶标数量显著高于5法[IS6110，16.9(0.0，698.0)比2.5(0.0，25.0)拷贝/20 μL反应体系，Z=-3.237，P=0.001；IS1081，7.1(0.0，224.0)比0.4(0.0，13.0)拷贝/20 μL反应体系，Z=-2.667，P=0.008]，2法提取核酸样本中的靶标数量也显著高于5法[IS6110，9.7(0.0，639.0)比2.5(0.0，25.0)拷贝/20 μL反应体系，Z=-3.157，P=0.002；IS1081，4.8(0.0，155.0)比0.4(0.0，13.0)拷贝/20 μL反应体系，Z=-2.250，P=0.024](图5)。

3 讨 论

结核性胸膜炎是一种少菌性结核病类型，病原学确诊率非常低。近年来，随着分子生物学检测技术的进步和推广，胸腔积液M.tb特异性核酸检测被用来提升结核性胸膜炎的病原学诊断效率。然而不同方法的检测效率差别非常大[8,12-13]，原因除了检测技术本身的差异，前期胸腔积液的处理方式和核酸提取方法也是影响检测效率的重要因素之一。理论上胸腔积液中M.tb核酸包括菌体核酸和菌体外的游离核酸，尚不清楚哪种比例更高。本研究设计采用了胸腔积液离心后上清(游离核酸)、胸腔积液离心后沉渣(菌体核酸)和胸腔积液原液3种思路，每种又尝试两种提取方法，以便综合比较了解不同核酸提取方法获得的核酸样本中M.tb特异性核酸数量差异。

研究表明，结核性胸膜炎患者胸腔积液中的M.tb核酸含量非常低，经常检测结果阴性。因此本研究采用了高灵敏的微滴数字PCR技术对靶标核酸进行绝对定量[14]。检测靶标选用M.tb特异的、基因组中通常含有多个拷贝的IS6110及IS1081序列以提高检出率。结果显示样本中检测到的IS6110和IS1081拷贝数具有正相关关系(相关系数r=0.92,P<0.0001)，两者均可以用来定量评估M.tb核酸提取的效果。

核酸提取方法比较结果提示，胸腔积液离心上清游离核酸提取以及原液直接核酸提取时，采用柱法和磁珠法的效果相当，因此这两种样本核酸提取时采用柱法和磁珠法均可。而对于含有M.tb菌体的离心沉渣样本，本研究在用化学破碎法提取M.tbDNA过程中尽管增加了溶菌酶的作用浓度和时间，但仍不能高效裂解M.tb(靶标检测数量极低)。因此，在胸腔积液沉渣核酸提取时强烈推荐使用物理破碎法来获取M.tbDNA。

胸腔积液离心上清游离核酸提取(柱法)、离心沉渣核酸提取(物理法)和胸腔积液原液直接核酸提取(柱法)3种方法相比较，前两种方法优于后者，原因除了提取方法本身的差异(如游离核酸提取柱相比于普通核酸提取柱对于小片段核酸的吸附力可能更强)，前两种方法按试剂盒要求提取的起始胸腔积液体积(4 mL)远大于后一种方法(0.7 mL)也是原因之一。(检测效果的灵敏度换算应该把体积差异因素考虑进去)

进一步比较胸腔积液离心上清游离核酸提取(柱法)和离心沉渣核酸提取(物理法)获得的核酸样本中M.tb核酸，发现上清样本IS6110拷贝数高于沉渣样本的有11例(样本#1、#3、#7、#11和#12等)，沉渣样本IS6110拷贝数高于上清样本的有6例(样本#6、#10和#16等)。该结果提示，结核性胸腔积液中M.tb菌体核酸和游离核酸哪种占比更多不能一概而论，不同患者会有所不同。这也提示，能同时考虑富集菌体核酸和游离核酸的方法有可能会提高检测效率。

以上仅是从提取的核酸样本中检测到的M.tb核酸数量进行方法比较，在实际工作中，选择哪种方法还需结合其他因素综合考虑。例如尽管胸腔积液原液直接核酸提取(柱法)检测到的拷贝数略低，但也有很多样本采用灵敏的数字PCR方法可以检测到靶标，同时该方法具有所需样本体积小(0.7 mL)、操作简单、价格便宜、除了离心机不需额外配备特殊仪器等优点。另外，目前游离核酸提取试剂盒相对较为昂贵，沉渣核酸提取(物理法)振荡破碎需专用仪器和破碎珠，磁珠法需磁力架，磁珠法易于实现机器自动化等，这些都是需要考虑的因素。

总之，本研究初步表明大体积胸腔积液离心上清游离核酸提取和离心沉渣核酸提取(物理破碎)是较好的适于结核性胸膜炎分子生物学检测的核酸制备方法。由于分析样本有限，下一步将进一步扩大样本评估这两种方法，并深入分析其联合数字PCR检测对结核性胸膜炎的具体诊断价值。

利益冲突：无

引用本文格式：应用于结核性胸膜炎分子生物学检测的胸腔积液核酸提取方法初步比较分析[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(8)：678-684. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.108