1株粗糙型布鲁氏菌诱导株RB71的生物学特性研究

辛凌翔，冯 宇，徐 磊，任小侠，孙浩杰，丁家波，毛开荣，李晓宁，李俊平，王 楠

布鲁氏菌是一种革兰氏阴性的兼性胞内寄生菌，主要寄生于巨噬细胞和胚胎滋养层细胞[1]。布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患传染病，可导致多器官慢性损伤，在世界范围内广泛流行，严重威胁人类食品安全和公共卫生安全[2]。预防控制布鲁氏菌病对畜牧业生产发展和人类健康至关重要[3]，为减轻布鲁氏菌病对人类和动物种群的影响，提出并制定可预防的策略十分关键[4]。到目前为止，疫苗免疫仍是防控该病的重要手段[5]，目前主要应用的疫苗为光滑型疫苗，虽然具有良好的免疫效果，但安全性不高，并且容易产生阳性血清干扰诊断，无法区分免疫牛和自然感染牛[6]。由于粗糙型布鲁氏菌毒力较弱，且能提供对光滑型布鲁氏菌的免疫保护，不会干扰临床检测，因此，开发适宜的粗糙型疫苗具有重要的意义。本实验室前期以布鲁氏菌A19为亲本株，利用op诱导剂成功诱导出布鲁氏菌弱毒株，命名为诱导株RB71。由于wboA基因编码光滑型布鲁氏菌脂多糖O侧链合成相关的糖基转移酶，wboA基因的不完整性对布鲁氏菌光滑表型存在重要影响[7]。通过结晶紫染色鉴定、热凝集试验、脂多糖完整性鉴定试验等方法，结合测序等技术发现，诱导株缺失的基因中含有wboA基因，诱导株连续培养30代基因组未发生突变，说明诱导株RB71为具有遗传稳定性的粗糙型布鲁氏菌。为进一步验证其安全性、免疫力与毒力，本实验利用布鲁氏菌病的小鼠感染模型[8]，模拟布鲁氏菌的感染，通过分离确认感染等指标[9]，探究粗糙型布鲁氏菌诱导株RB71的生物学特性。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和试验动物 牛种布鲁氏菌诱导株RB71，由本实验室诱导制备[10]；牛种布鲁氏菌疫苗株A19，检验用布鲁氏菌强毒株M28[11]，来自国家兽医微生物菌种保藏中心；SPF级5～7周龄雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，购买后饲养于生物安全三级实验室的独立送风负压饲养系统。涉及布鲁氏菌活菌的试验操作及动物试验均在中国兽医药品监察所BSL-3、ABSL-3实验室内完成。

1.1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)和胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)购自BD公司；胰蛋白胨、酵母浸出膏购自Sigma公司。

1.1.3 主要仪器 恒温培养箱，游标卡尺。

1.2 药敏试验 药敏纸片扩散法：将亲本株A19和诱导株RB71分别以109CFU/mL涂布TSA平板，并在平板中央放置药敏纸片，β-内酰胺类抗生素包括青霉素(penicillin)、氨苄青霉素(ampicillin)、羧苄青霉素(carbenicillin)；非β-内酰胺类抗生素包括环丙沙星(ciprofloxacin)、链霉素(streptomycin)、四环素(tetracycline)、多粘菌素(polymyxin)、利福平(rifampin)，37 ℃孵育72 h后用游标卡尺测量抑菌圈大小。

1.3 最小免疫剂量测定试验 用TSA培养基复苏保存于-80 ℃冰箱的诱导菌株RB71，并扩大培养至对数生长期，进行活菌计数，用生理盐水稀释至1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011CFU/只的免疫剂量。将60只5～7周龄BALB/c雌性小鼠，随机分成6个免疫组，10只/组，同时设立PBS对照组。免疫45 d后，对6组小鼠进行布鲁氏菌强毒株腹腔注射攻毒，攻毒后45 d剖杀小鼠，无菌采取脾脏，研磨，10倍比稀释匀浆液，每只小鼠均取100 μL稀释菌液涂抹到TSA平板上，37 ℃恒温培养箱中培养3～5 d，进行菌落计数，确定诱导株的最小免疫剂量。

1.4 小鼠体内感染试验 利用小鼠感染模型，对RB71诱导株的毒力和免疫保护力进行评价[12]。用TSB培养基将布鲁氏菌A19株、RB71诱导株培养至稳定期，细菌计数并用生理盐水将细菌稀释至1×109CFU/mL。将5～7周龄雌性BALB/c小鼠27只，分组、每组9只，其中一组设为PBS对照组，其余两组分别为亲本株A19组和诱导株组，对小鼠腹股沟皮下注射免疫，每只100 μL(108CFU/只)。在免疫后2周、5周和8周解剖小鼠，无菌采取小鼠脾脏，研磨脾脏组织，10倍比稀释后，涂布TSA平板，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养3～5 d，计算脾脏细菌载量[13]。

1.5 统计学分析 使用Graphpad Prism 5软件对试验数据进行分析。实验结果以平均值和标准误来表达，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 药敏试验结果 为探究缺失基因是否影响细菌对抗生素的耐受程度，本实验通过药敏纸片扩散法，分别以相同浓度涂布TSA平板，孵育后测量抑菌圈大小，来测定亲本株A19、诱导株RB71对β-内酰胺类抗生素和非β-内酰胺类抗生素的敏感性。通过对包括青霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、环丙沙星、链霉素、四环素、多粘菌素、利福平在内的8种抗生素进行检测，结果如图1所示，两个菌株对8种抗生素的抑菌程度差异无统计学意义。因此，诱导株RB71相关基因的突变并没有改变细菌对β-内酰胺类抗生素和非β-内酰胺类抗生素的敏感性。

2.2 诱导株RB71最小免疫剂量的测定试验结果 诱导株RB71以1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011CFU/只的剂量腹股沟注射免疫小鼠45 d后，用强毒株M28 以1×103CFU/只的剂量进行攻毒试验，45 d后，剖杀并无菌取脾脏，图2为布鲁氏菌诱导株RB71以不同剂量感染小鼠后脾脏的直观图。脾脏分菌结果如表1所示：对照组全部分离出细菌，保护率为0，对照成立；免疫试验组在免疫剂量为109CFU/只时，50%(5/10)小鼠脾脏分离不到活菌，保护率达50%；免疫剂量为1010CFU/只时，30%(3/10)小鼠脾脏分离不到活菌，免疫保护率开始下降；免疫剂量为1011CFU/只时，20%(2/10)小鼠脾脏分离不到活菌，保护率降至20%。脾脏分菌结果显示，当免疫剂量为1×109CFU/只时，免疫保护率最高，当免疫剂量达1×1011CFU/只时，感染小鼠后免疫保护程度反而降至与1×108CFU/只组相同，仅有20%的感染小鼠得到保护。因此，确定诱导株RB71对小鼠的最小免疫剂量为1×109CFU/只。

表1 诱导株RB71对感染小鼠的保护情况及感染小鼠的脾脏分离的活菌数量Tab.1 The protective effect of induced strain RB71 on infected mice and the status of bacteria shedding of infected mice

2.3 诱导株RB71的毒力测定试验结果 为研究诱导株RB71在小鼠体内的毒力是否发生改变，将亲本株A19和诱导株RB71以1×108CFU/只的剂量腹股沟皮下注射5～7周龄SPF级BALB/c小鼠，并在感染后2周、5周和8周剖杀小鼠，通过脾脏称重和载菌量的方法评价细菌毒力，试验结果如图3和图4所示。感染后2周、5周和8周，RB71感染组的小鼠脾脏重量均低于A19感染组，其中感染后2周和8周存在差异(P<0.05)，感染后5周存在差异(P<0.01)，A19感染组的小鼠脾脏主要表现为体积增大，RB71感染组与空白对照组小鼠脾脏大小无明显差异(P>0.05)。感染后5周，33%(1/3)的RB71感染组小鼠体内细菌已被清除，A19感染组的脾脏载菌量仍维持高位；感染后8周，RB71感染组小鼠体内细菌已全部清除，A19感染组的脾脏载菌量仍保持较高水平。由此可知，诱导株RB71对小鼠的毒力较弱，且毒力显著低于亲本株A19。

3 讨 论

布鲁氏菌脂多糖(LPS)是否具有完整的O链是区分粗糙型布鲁氏菌与光滑型布鲁氏菌的依据，光滑型布鲁氏菌具有完整的O链，粗糙型布鲁氏菌没有O链或O链不完整[14]。光滑型布鲁氏菌和粗糙型布鲁氏菌在血清学试验上无交叉反应，但可具有免疫交叉保护性。目前我国对牛布鲁氏菌病应用的疫苗主要是A19疫苗，但由于A19疫苗株为光滑型布鲁氏菌强毒株，使得免疫时易造成环境污染和人员感染，且无法用常规的血清学检测方法鉴别诊断免疫动物和自然感染动物[15]。开发粗糙型布鲁氏菌疫苗可有效解决光滑型疫苗免疫不能区分自然感染与疫苗免疫的问题。获得粗糙型布鲁氏菌突变体的方法主要包括，培养过程中自发变异、在不同培养基或体内中连续传代变异、利用分子遗传学的方法诱变等[16]。本实验室前期以A19株为亲本株，通过op诱导剂诱导的方法，已获得了1株粗糙型的具有良好遗传稳定性的牛种布鲁氏菌诱导株[10]。相对于抗生素抗性培养基筛选获得的菌株，该方法诱导效率更为高效，还可以避免由于抗生素抗性基因的存在而导致的菌株对抗生素不敏感的问题，更好地保证生物安全性[17-18]。

为探究缺失基因是否会影响或改变细菌对抗生素的耐受程度，本研究通过药敏试验发现，亲本株A19与诱导株RB71对β-内酰胺类抗生素和非β-内酰胺类抗生素的敏感性无显著差异。为验证诱导株RB71作为疫苗候选株对动物的保护力，本研究通过动物试验测定了诱导株RB71免疫小鼠后的攻毒保护率，结果显示其最佳免疫剂量为109CFU/只，保护率可以达到50%。诱导株RB71最小免疫剂量测定试验中发现，当免疫剂量高于1×109CFU/只时，免疫保护率逐渐下降，分析主要原因为诱导株RB71虽为毒力弱的菌株，但是活菌在体内仍具备繁殖能力及一定的致病性，当诱导株RB71免疫剂量较小时，无法抵抗强毒株的感染，免疫保护率较低。但当免疫剂量高于1×109CFU/只时，本实验中免疫后90 d，小鼠脾脏可能无法清除感染的菌株。究竟脾脏分离的菌株是感染的强毒株还是免疫的RB71株，或是两种菌株共同存在，仍需通过进一步毒力试验进行验证。通过测定感染小鼠脾脏的载菌数和脾脏大小来评价布鲁氏菌诱导株RB71的毒力强弱[19]，证实诱导株RB71引起脾脏肿大程度远低于亲本株A19，其感染机体后能被逐渐清除，即毒力减弱后仍能引起一定的免疫反应，能对动物抗体产生一定保护力。通过对诱导株RB71的生物学特性研究，证明诱导株RB71对抗生素敏感、毒力小，具有良好的免疫原性。为研究制备一种低毒力、高安全性的布鲁氏菌病疫苗株提供新的可能。

利益冲突：无

引用本文格式：辛凌翔，冯宇，徐磊，等. 1株粗糙型布鲁氏菌诱导株RB71的生物学特性研究[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(8)：693-697. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.094