肺泡灌洗液二代基因测序在鹦鹉热衣原体感染肺炎诊断中的应用

周柳如，方锦龙，张平

东莞市人民医院 呼吸与危重症医学科，广东 东莞 523000

0 引言

鹦鹉热衣原体属于一种严格胞内寄生的需氧革兰阴性菌，是介于细菌与病毒之间的特殊病原微生物，宿主主要是鸟类、家禽、家畜等，可经密切接触、气溶胶途径发生人畜传染[1]。鹦鹉热衣原体感染人体后最常累及的脏器是肺部，但由于鹦鹉热衣原体所致肺炎较为罕见，临床仍缺乏快速、精准的诊断手段。二代基因测序（NGS）技术为近年新兴的一种DNA/RNA检测技术，具有检测速度快、灵敏度高等优点，适用于重症或疑难病例病原学鉴别诊断[2]。但关于NGS技术应用于鹦鹉热衣原体感染肺炎诊断中的相关报道较少。鉴于此，本研究对我院收治的13例鹦鹉热衣原体感染肺炎患者的肺泡灌洗液进行NGS检测，分析NGS技术对鹦鹉热衣原体感染肺炎的诊断价值，旨在为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年3月-2021年4月东莞市人民医院收治的13例鹦鹉热衣原体感染肺炎患者作为研究对象，13例患者中男10例，女3例；年龄45～81岁，平均（62.98±7.07）岁；10例患者有家禽接触史，包括3例接触鸡鸭，4例接触鸽子，3例接触其他鸟类，剩余3例接触史不明确；基础疾病史：7例合并冠心病，6例合并高血压，5例合并2型糖尿病，2例合并慢性乙肝，6例合并房颤。本研究已获得医院医学伦理委员会审批。

纳入标准：①符合鹦鹉热衣原体肺炎的诊断标准[3]，有咳嗽、咳痰、呼吸困难等临床表现；②在呼吸道样本中检测到鹦鹉热衣原体病原微生物，或微免疫荧光实验检测到抗鹦鹉热衣原体IgM抗体滴度1∶16；③患者自愿接受检查，签订了知情同意书。排除标准：①伴有其他肺部疾病；②不配合样本采集者。

1.2 方法

1.2.1 肺泡灌洗液NGS技术检测

①肺泡灌洗液采集：在局麻下行支气管肺泡灌洗术。即置入纤维支气管镜，将其嵌于肺叶目的片段，往肺内注入温的灭菌生理盐水20mL，再负压抽吸10mL灌洗液到无菌专用容器中送检；②检测：应用BGISEQ-100平台（深圳华大基因股份有限公司）进行NGS检测，具体方法：a.DNA提取：取3mL肺泡灌洗液，经玻璃珠混合震荡后使用TIANamp Mico DNA Kit试剂盒[DP316，天根生化科技（北京）有限公司]，严格按照试剂盒说明书提取DNA。b.构建文库和测序：取提取所得的DNA，使用Agilent 2100 Bioanalyzer质控文库插入片段大小，使用QubitdsDNA Hs Assay Kit（Thermo Fisher Scienti6c Inc.）质控DNA文库浓度，经环化形成单链环形结构。环化后的文库经滚环复制生成DNA纳米球。制备好的DNA纳米球加载到测序芯片，使用BGISEQ-50进行测序。c.数据分析：获得测序数据后将长度小于35bp、低质量的数据去除以获得高质量的数据。应用BWA软件将测序所得的病原序列与病原库进行对比，然后再去宿主化扣除正常人群中出现的微生物群落背景，来找到所检测临床标本中可能致病的微生物。结果判断：NGS检测得到的微生物读数，至少比其他微生物高2倍，则鉴定的微生物被分类为确认的病原体。

1.2.2 肺泡灌洗液传统病原检测

取“1.2.1”步骤中10mL肺泡灌洗液，应用德国布鲁克质谱仪进行鉴定，使用法国生物梅里埃公司ⅥIEK-2、美国BD公司M-50法国生物梅里埃公司的VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定仪，美国BD公司M-50自动微生物鉴定和药敏分析系统。进行细菌生化鉴定和药敏试验。

1.2.3 痰液NGS检测

指导患者深呼吸用力咳嗽，将咳出的痰液保存到无菌容器内送检。NGS检测方法与“1.2.1”相同。

1.3 观察指标

①比较肺泡灌洗液NGS、肺泡灌洗液传统病原测定、痰样本NGS检测鹦鹉热衣原体的阳性率。②比较三种检测方法的结果回报耗时。③随访记录13例患者的预后转归情况。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件，计量资料用（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同检测方法的检测结果比较

肺泡灌洗液NGS对鹦鹉热衣原体的阳性检出率显著高于传统病原测定和痰样本NGS（χ2=9.370，P=0.009），见表1。

表1 不同检测方法的检测结果[n(%)]

2.2 不同检测方法的结果回报耗时比较

肺泡灌洗液NGS、痰样本NGS的检测结果回报耗时显著短于传统病原测定（P＜0.05），见表2。

表2 不同检测方法检测所需时间比较

2.3 预后转归情况

13例患者确诊为鹦鹉热衣原体感染后，11例予以多西环素治疗，2例采用莫西沙星治疗，并根据药敏试验经验性配合其他抗生素。经氧疗、药物抗感染、呼吸支持等处理后，11例患者病情明显好转出院，2例治疗无效，这考虑为患者伴有其他并发症。其中1例患者因伴有大面积脑梗死，家人放弃治疗办理出院。另1例患者伴有多种基础疾病，基础状态较差，住院期间反复发热，合并脓毒血症，呼吸循环功能衰竭，最终导致死亡。

3 讨论

最早于1879年欧洲就首次报道了人类可感染鹦鹉热衣原体，鹦鹉热主要是指感染鹦鹉热衣原体而导致的人畜共患病，人类通过接触鸟类的尿液、粪便或其他排泄物或通过气溶胶途径可传播感染，进展成流感样疾病、肺炎[4]。实际上，鹦鹉热在临床中并不常见，而且有调查数据显示，亚洲国家鹦鹉热患病率显著低于澳大利亚、欧洲[5]。另由于本病诊断缺乏敏感性、特异性较高的检测方法，具体流行病学特征尚未明确。

人体感染鹦鹉热衣原体后，主要累及肺部，临床表现为发热恶寒、干咳、头痛、咽喉疼痛等非特异性的流感症状，病情严重的可发展为重症肺炎，发生意识模糊、呼吸困难等。因此，从症状体征来看，鹦鹉热衣原体感染肺炎缺乏特异性症状，临床诊断较难。在影像学诊断方面的特异性也不高，有研究报道[6]，鹦鹉热衣原体肺炎患者中有90%病例的肺部X线片可见异常，肺内出现不同程度渗出和实质性病变，与其他类型肺炎无明显的差异。

当前临床诊断鹦鹉热主要通过临床表现、鸟类接触史进行初步疾病诊断，但在实际临床中部分患者并没有鸟类接触史，极易引起了漏诊、误诊。而本病确诊方法为传统微生物检测，主要是通过涂片镜检、微生物培养法、PCR扩增等方法鉴别采集的样本中的病原种类及其定量信息，但该法耗时相对较长（一般需要5～7天），且结果极易受抗菌药物使用所影响，存有一定的局限性[7]。另有文献指出[8]，鹦鹉热衣原体的分离、培养效率较低，传统病原学测定阴性概率较大，不利于诊治。随着医学检测技术的进步，为了提高病原微生物检测的效率及其精确度，二代基因测序技术应运而生。二代基因测序技术主要是通过对宏基因组的样本开展大规模测序，以获得基因组核酸序列，再借助生物信息工具进行定量分析，获得详细的病原基因信息[9]。也有研究证实[10]，二代基因测序技术具有无培养样本、检测时间短、测定灵敏度高、可测定未知病原体等优点，能够弥补传统微生物检测的不足之处，为临床疾病诊治提供新的可靠依据。本研究将二代基因测序技术应用于鹦鹉热衣原体感染肺炎诊断中，结果发现，无论是应用肺泡灌洗液还是痰样本，应用二代基因测序技术所需耗时均短于传统病原学测定，提示应用NGS测序技术检测报告快，能够显著降低诊断时间，利于临床及时早期治疗。

此外，本研究还对不同呼吸道样本的NGS检测及传统病原学测定效果进行分析，结果发现，肺泡灌洗液、痰样本NGS测定的阳性率显著高于传统病原测定，说明NGS技术的检测优势优于传统病原学。而且肺泡灌洗液NGS的阳性率优于痰样本，这是因为肺泡灌洗液没有口腔、上呼吸道定植菌的干扰[11]。因此，应用肺泡灌洗液进行NGS检测对鹦鹉热具有较高的诊断价值。

鹦鹉热衣原体为衣原体科病原微生物，主要应用抑制致病菌DNA、蛋白质合成的抗菌药物，如四环素类（如多西环素等）、大环内酯类抗生素（如莫西沙星等）[12-13]。本研究中13例患者经NGS测定发现为鹦鹉热衣原体所致肺炎后，及时调整治疗方案，11例采用多西环素治疗，2例采用莫西沙星治疗，结果11例患者病情好转出院，另2例因伴有其他系统并严重并发症而自动放弃救治或死亡，提示NGS技术检测能够快速明确疾病诊断，最大限度缩短了患者病程，利于有效改善患者的预后，也可减少后续非必要的治疗费用，能够在一定程度上抵消NGS检测费用高的问题，同时还可以减少不必要抗菌药物应用，避免耐药现象。

综上所述，与传统病原学检测相比，应用肺泡灌洗液NGS对鹦鹉热衣原体感染肺炎有更高的检出率，且其检测耗时短，利于临床早期、准确诊治，有效改善患者的预后。但本研究纳入病例数较少，只有13例肺泡灌洗液进行NGS检测，今后研究仍需扩大样本量，延长随访时间以进一步验证结论。