系统性硬化病患者血清lncRNA MEG3表达及其与Th17/Treg平衡的关系研究

郝 钰，李 波

济南市中医医院检验科，山东济南 250012

系统性硬化病(SSc)是一种结缔组织病变，可累及皮肤、肾脏、心脏、消化道等，损害患者身心健康[1-2]。有研究认为，SSc发病与免疫失调、环境、微小RNA(miRNA)、血管纤维化、长链非编码RNA(lncRNA)等有关[3-4]。研究发现，辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)在SSc中失衡，其可能通过影响免疫水平影响SSc发生、发展[5]。另外，lncRNA人母系表达基因3(MEG3)在类风湿关节炎(RA)中呈低表达，其可能通过调节炎性反应，进而影响RA病变过程[6]；而在SSc患者中，微小RNA-21(miR-21)可促进纤维化，lncRNA MEG3可靶向调节miR-21表达[7-8]。由此推测，SSc患者中lncRNA MEG3表达水平可能与Th17/Treg平衡有关。本研究旨在通过测定lncRNA MEG3在SSc患者血清中的表达情况，分析lncRNA MEG3与Th17/Treg平衡的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2021年3月本院诊治的54例SSc患者作为SSc组。其中男8例，女46例；年龄25～57岁，平均(41.35±12.56)岁；病程3～24个月，平均(13.78±8.29)个月。另选取同期54例体检健康者作为对照组，其中男10例，女44例；年龄25～57岁，平均(42.63±12.70)岁；无自身免疫性疾病史。SSc组与对照组性别、年龄等比较，差异无统计学意义(P>0.05)。SSc组纳入标准：(1)符合文献[9]中的SSc诊断标准；(2)病程≤24个月，临床资料完整。排除标准：(1)合并心血管疾病、急性感染者；(2)合并精神疾病、肿瘤者；(3)合并肝、肾原发性疾病者；(4)皮肤硬化且处于晚期、皮肤严重萎缩者；(5)哺乳期、妊娠期女性。本研究符合《赫尔辛基宣言》要求，获得本院伦理委员会批准，且受试者及其家属签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本收集 分别收集健康体检者、SSc患者清晨空腹外周血6～7 mL，分成两份，一份置于含肝素抗凝剂的抗凝管内，用于Th17、Treg细胞百分比检测；另一份置于5 mL EP管内，自然凝集25 min后，3 800 r/min离心7 min(离心半径为8 cm)，分离血清，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2流式细胞术检测Th17、Treg细胞水平 取1.2.1中的抗凝血，按密度梯度离心法使用人Ficoll淋巴细胞分离液(上海雅吉生物科技有限公司)获取外周血单个核细胞(PBMCs)，利用RPMI 1640培养液(南京维森特生物技术有限公司)将PBMCs稀释为1.5×106个/mL的细胞悬液，流式细胞仪(型号：FACSCantoⅡ，美国BD公司)检测Th17、Treg细胞百分比，求Th17/Treg比值。

1.2.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测血清lncRNA MEG3、miR-21、维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)mRNA、叉头/翼状螺旋转录因子3(Foxp3)mRNA表达水平 解冻血清，按TRIzol试剂盒(上海爱必信生物科技有限公司)说明书提取总RNA，用超微量分光光度计(美国Quawell公司)按cDNA逆转录试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)说明书将RNA逆转录为cDNA。使用2×SYBR Green QPCR mix试剂盒(美国AMEKO公司)及RT-qPCR仪(CFX96型，美国Bio-Rad公司)对cDNA进行PCR扩增。采用2-ΔΔCt法计算血清lncRNA MEG3、miR-21及Foxp3 mRNA、RORγt mRNA相对表达水平，lncRNA MEG3、RORγt、Foxp3以GAPDH为内参，miR-21以U6为内参，各引物序列见表1。

表1 lncRNA MEG3、Foxp3、RORγt、miR-21及GAPDH、U6的引物序列

2 结 果

2.1两组血清lncRNA MEG3、miR-21及外周血Th17、Treg、Th17/Treg比较 与对照组相比，SSc组患者血清lncRNA MEG3表达水平、Treg细胞百分比降低(P<0.05)，miR-21表达水平、Th17细胞百分比、Th17/Treg升高(P<0.05)，见表2。两组Th17(CD4+IL-17+)、Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞水平见图1、2。

表2 两组血清lncRNA MEG3、miR-21及外周血Th17、Treg、Th17/Treg比较

注：A为对照组；B为SSc组；百分率为CD4+IL-17+/CD4+ T细胞比例。

注：A为对照组；B为SSc组；百分率为CD4+CD25+Foxp3+/CD4+ T细胞比例。

2.2两组血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表达水平比较 与对照组相比，SSc组患者血清RORγt mRNA表达水平升高(P<0.05)，Foxp3 mRNA表达水平降低(P<0.05)。见表3。

表3 两组血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相对表达水平比较

2.3SSc患者血清lncRNA MEG3、miR-21表达水平与外周血Th17、Treg、Th17/Treg相关性 Pearson法分析显示，SSc患者血清lncRNA MEG3表达水平与Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg及血清miR-21表达水平与Treg、Foxp3 mRNA呈负相关(P<0.05)，血清lncRNA MEG3表达水平与Treg、Foxp3 mRNA及血清miR-21表达水平与Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 SSc患者血清lncRNA MEG3、miR-21表达水平与Th17、Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相关性

2.4SSc患者血清lncRNA MEG3表达水平与miR-21的相关性 Pearson法分析显示，SSc患者血清lncRNA MEG3表达水平与miR-21呈负相关(r=-0.564，P<0.05)。见图3。

图3 SSc患者血清lncRNA MEG3表达水平与miR-21相关性

2.5影响SSc发生的影响因素分析 以是否发生SSc为因变量(发生=1，未发生=0)，采用Enter法纳入和剔除变量(α剔除=0.10，α入选=0.05)，以lncRNA MEG3(实测值)、miR-21(实测值)、Th17(实测值)、Treg(实测值)、RORγt mRNA(实测值)、Foxp3 mRNA(实测值)、Th17/Treg(实测值)为自变量，Logistic回归分析显示，lncRNA MEG3是影响SSc发生的保护因素(P<0.05)，miR-21、Th17/Treg是影响SSc发生的危险因素(P<0.05)。见表5。

表5 Logistic回归分析SSc发生的影响因素

3 讨 论

SSc是一种多发于女性的自身免疫系统疾病，以内脏纤维化、皮肤增厚为主要特征，病死率高[10-11]，寻找与SSc发病相关因素并及时干预对改善患者生存情况有积极意义。

既往研究发现，miR-21在SSc血管病变及纤维增生性改变中起促进作用，其可能是SSc的治疗靶点[12]。lncRNA可调节相关信号转导、免疫炎性反应，且lncRNA MEG3作为lncRNA的一员，其可通过靶向调节miR-21表达，进而影响银屑病发生、发展[8,13]。有报道显示，lncRNA MEG3在RA中表达下调，其可能靶向调节有关基因进而影响RA病理变化[14]。研究显示，lncRNA MEG3在强直性脊柱炎中表达水平降低，其可能调节炎性反应，进而影响强直性脊柱炎病变进程，lncRNA MEG3可能是治疗强直性脊柱炎的潜在靶标[15]。本研究探究了lncRNA MEG3、miR-21与SSc的关系，结果显示，SSc患者血清lncRNA MEG3表达水平较低，与其在RA患者中的表达情况一致[14]，miR-21表达水平较高，与HENRY等[12]研究结果相符，提示lncRNA MEG3、miR-21表达失调可能与SSc发生有关。由此推测，lncRNA MEG3可能靶向调控miR-21，进而调节血管病理变化，影响免疫炎性反应，从而在SSc病变过程中发挥作用，但相关机制仍需深入研究。

免疫系统维持着机体对外界刺激的反应与免疫耐受间的平衡，其中Th17/Treg平衡是保证免疫稳态的重要环节，Th17/Treg在复发缓解型多发性硬化患者中较高，其可能在多发性硬化中起重要免疫调节作用[16]。RORγt、Foxp3分别是Th17、Treg细胞的关键转录因子，RORγt影响Th17细胞分化及IL-17分泌，调节炎性反应，而Foxp3可与染色体结合，调控多种基因表达，在免疫功能、Treg细胞发育中具有重要作用[17-18]。本研究显示，与体检健康者相比，SSc患者Th17细胞百分比、Th17/Treg、血清RORγt mRNA表达水平较高，Treg细胞百分比及血清Foxp3 mRNA表达水平较低较低，与李丹等[16]、LEI等[19]、乐静等[20]研究一致，提示Th17、Treg细胞、RORγt、Foxp3可能参与并影响SSc病理发展，分析可能原因，Th17细胞增多会增强免疫炎性反应，Treg细胞减少会降低免疫炎症抑制作用强度，Th17、Treg细胞比例失衡，打破免疫平衡，Th17、Treg细胞在SSc疾病进展中起免疫调节作用，而RORγt、Foxp3可能通过影响Th17、Treg细胞功能，调节炎性反应，进而在SSc中发挥调节作用。

此外，ZHENG等[21]报道显示，miR-21可调节Th17/Treg平衡。本研究探讨了lncRNA MEG3、miR-21表达水平与Th17、Treg、Th17/Treg的相关性，结果显示SSc患者血清lncRNA MEG3、miR-21表达水平与Th17、Treg、Th17/Treg、RORγt、Foxp3 mRNA均相关，提示lncRNA MEG3、miR-21可能与RORγt、Foxp3、Th17、Treg、Th17/Treg共同影响SSc发病进程。本研究还发现，SSc患者血清lncRNA MEG3表达水平与miR-21呈负相关，分析可能原因，lncRNA MEG3可能通过调节miR-21表达，进而调节Th17/Treg平衡，从而影响SSc病理进展。Logistic回归分析显示，lncRNA MEG3表达降低，miR-21、Th17/Treg升高均会增加SSc发生风险，及时检测上述指标水平可能有助于及早诊治SSc。

综上所述，lncRNA MEG3在SSc患者中表达下调，与miR-21、Th17/Treg平衡密切相关，为临床诊治SSc提供了新思路。但本研究样本量较小，后期需增加样本量，从多中心、多角度探讨lncRNA MEG3与SSc的关系，以提高研究的可靠性。