新型精胺氧化酶抑制剂SI-4650对人卵巢癌SKVO-3细胞增殖和上皮细胞间质化的影响*

杨建林， 田家俊， 张 浩， 陈倩影， 吕亚丰， 曹春雨

(三峡大学医学院， 肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室， 湖北 宜昌 443002)

恶性肿瘤的发生、发展和侵袭转移与肿瘤细胞中高多胺含量和多胺代谢异常密切相关，因此近年来多胺代谢途径成为抗肿瘤防治的研究热点被广泛重视[1，2]，精胺氧化酶(spermine oxidase, SMO)是多胺代谢途径中的关键酶，对维持细胞中多胺含量和代谢的稳态起重要作用。已有研究报道[3-5]，高表达SMO是多种恶性肿瘤的重要诱发因素和预后不良的指征，与胃肠癌、前列腺癌和结肠癌等恶性肿瘤的发生、发展密切相关。因此作为抗肿瘤药物研发的重要方向之一，寻找靶向SMO抑制剂受到广泛关注[6]。本实验室前期研究发现，小分子SI-4650作为一种新型SMO抑制剂，能通过有效抑制SMO活性，干扰细胞多胺代谢、耗竭多胺含量等机制发挥对人非小细胞肺癌A549细胞的抗肿瘤活性[7]。本研究针对人卵巢癌SKVO-3细胞，验证SI-4650是否能同样对人卵巢癌SKVO-3细胞发挥抗肿瘤活性，并探究其相应的机制。为人卵巢癌临床治疗药物研发和抗肿瘤研究提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料

人卵巢腺癌细胞SKVO-3细胞购于上海中国科学院细胞库，SI-4650 购自荷兰Specs生物特殊化合物公司，细胞培养相关试剂(DMEM细胞培养基、胎牛血清、双抗等)均购自美国Gibco公司，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自美国Sigma公司，凋亡途径相关蛋白(Bax、Bcl-2)、EMT途径相关蛋白(Vimentin、E-Cadherin、N-Cadherin)、基质金属蛋白酶MMP2、MMP9等抗体均购自Proteintech公司， 各类检测试剂盒(CCK8检测试剂盒、PI/FITC-Annexin V双染凋亡检测试剂盒、ROS检测试剂盒、JC-1检测试剂盒)均为上海碧云天生物科技有限公司产品，Transwell Permeable Supports 为美国Corning公司产品。

1.2 细胞培养和CCK8法检测细胞增殖

人卵巢癌SKVO3细胞用DMEM完全培养基(含10%FBS、100 U/ml 青霉素、100 μmol/L链霉素)在5%CO2细胞培养箱中37℃培养。分别用SI-4650(终浓度0、15、30、60、120 μmol/L)处理细胞24、48、72 h，同时设有无细胞的空白组。按照CCK8试剂盒说明书操作，加入CCK8试剂37℃孵育1 h，450 nm波长处检测每孔吸光度A值。SKVO-3细胞生长抑制率=[1-(A药物处理组- A空白组)/(A未加药组- A空白组)]×100%。

1.3 实验分组

将对数生长期SKVO-3细胞随机分为3组：正常对照组(未加药)和药物低、高浓度(根据上步CCK8实验结果， SI-4650终浓度分别为30，60 μmol/L)实验组，每组设置3个复孔，均培养48 h，用于后续机制研究实验。

1.4 化学发光法检测细胞中SMO酶活性

化学发光法直接检测SKVO-3细胞内SMO的酶活性实验：参照文献 [8]，将3个组细胞分别加入甘氨酸溶液(0.083 mol/L, pH 8.0)放置于-80℃冰箱中24 h，低温高速离心，取相等蛋白质含量的各组细胞上清液，检测其中酶促反应产物引起的化学发光物质荧光强度，用相同蛋白质量(mg)和时间(s)内的荧光强度(RLU)表示细胞中SMO酶活性(RLU.mg/(protein.s))。

流式细胞仪检测SMO酶促反应产物ROS含量实验：将3个组细胞按照ROS活性氧检测试剂盒说明书操作，无荧光的DCFH-DA进入细胞，经胞内的酯酶水解和ROS氧化转变为具有荧光的DCF，流式细胞仪检测DFC荧光强度表示细胞内活性氧的含量。

1.5 高效液相色谱法检测细胞中多胺含量

收集3个组细胞裂解后低温离心，取相等蛋白含量的各组细胞裂解上清液，用ddH2O补足体积，依次加入10 μl苯甲酰氯、20 μl DAH(1 mmol/L)、500 μl NaOH(2 mol/L)混匀后30℃水浴，加入NaCl饱和溶液终止反应，用乙醚混匀萃取3次，将萃取物用 1 ml甲醇溶解过滤。以Luna C18色谱柱为固定相， 38∶62比例混合的乙腈-水为流动相，254 nm 波长下检测萃取物的吸光度值，绘制流出曲线。计算单位蛋白质量(mg)中多胺的浓度(μmol)来表示样品中多胺的含量(μmol.mg/protein)。

1.6 Trabswell法检测细胞侵袭、迁移

将3个组细胞用DMEM培养基(含0.2% BSA)重悬。24孔细胞培养板中加入800 μl/well的DMEM培养基(含20% FBS)，将检测迁移能力的Transwell小室和检测侵袭能力铺有基质胶的Transwell小室放入24孔板中，并分别加入收集的3个组细胞，置37℃、5% CO2培养箱中继续培养18 h，将小室依次多聚甲醛(4%)固定，结晶紫染色，擦除膜内侧细胞并洗涤后，倒置显微镜下观察穿过小室膜孔的细胞并拍照。

1.7 PI单染流式细胞术法检测细胞周期

将3个组细胞分别用PBS配置的 75%乙醇固定过夜，离心收集细胞，加入500 μl PBS(0.1% TritonX-100、50 μg/L Rnase、0.02 g/L PI)重悬细胞，避光孵育30 min，流式细胞仪检测处于不同细胞周期的细胞比例。

1.8 PI/FITC-Annexin V双染流式细胞术法检测细胞凋亡

流式细胞术检测凋亡细胞率实验：收集3个组细胞，按照PI/FITC-Annexin V试剂盒说明书，每样品中加入5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

流式细胞术检测线粒体膜电位实验：按照JC-1试剂盒说明书操作，当细胞线粒体膜电位由强变弱时，原本聚集在线粒体基质中的JC-1聚合物解聚，以单体形式出现细胞中，发出绿色荧光。通过检测单体JC-1绿色荧光强度可确定线粒体膜电位的变化。

1.9 Western blot法检测细胞凋亡、侵袭迁移相关蛋白表达水平

收集3个组细胞裂解离心后，取相等蛋白含量的各组细胞裂解上清液，经电泳、电转印，5%脱脂牛奶封闭后，用目的蛋白抗体孵育PVDF膜结合过夜，再加入对应二抗孵育2 h，化学发光法显影拍照并灰度分析，目的蛋白灰度/β-actin蛋白灰度表示目的蛋白相对表达量。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 SI-4650对SKVO-3细胞增殖的影响

细胞增值实验结果显示(表1)，随SI-4650剂量增加和时间的延长，对SKVO-3细胞增殖抑制效率逐渐增加(P<0.01)。SI-4650处理SKVO-3细胞48 h，计算其IC50值为(68.13±5.48)μmol/L。因此在后续实验中设定，SI-4650终浓度为30 μmol/L(低浓度实验组)和60 μmol/L(高浓度实验组)处理48 h的SKVO-3细胞为实验组，以未加药细胞(以0 μmol/L SI-4650表示)为正常对照组。

Tab. 1 Effects of SI-4650 on the proliferation rate of SKVO-3 cells(%,¯ n=3)

2.2 SI-4650对SKVO-3细胞SMO酶活性的影响

HPLC分析表明，对照组中未检测到SI-4650，实验组中随培养基中SI-4650浓度的增加，SKVO3细胞中SI-4650含量也逐渐增加(P<0.01，表2)。

如表2所示，SI-4650能显著性抑制SKVO-3细胞中SMO的酶活性，使之从3362.45(RLU)RLU/(mg·s)下降至1413.26(RLU)RLU/(mg·s)。HPLC结果也证实SMO酶促反应产物Spd含量从2.11 μmol/mg显著减少至0.92 μmol/mg(表3)，流式细胞仪检测DFC荧光强度下降，也证实另一种酶促反应产物ROS随SI-4650增加而减少(表2 )。同时可见，细胞中总多胺含量呈浓度依赖性显著下降(表3)，与对照组相比较，以上结果均有统计学意义(P<0.01)。提示SI-4650可有效进入SKVO-3肿瘤细胞中，通过抑制SMO酶活性，干扰正常多胺代谢稳态，减少细胞总多胺含量发挥相应生物学效应。

Tab. 2 Effects of SI-4650 on SMO activity of SKVO-3 n=3)

Tab. 3 Effects of SI-4650 on intracellular polyamine contents of SKVO-3 cells(μmol.mg/protein， n=3)

2.3 SI-4650对 SKVO-3细胞侵袭、迁移能力的影响

Transwell分析结果表明，SI-4650处理后，SKVO-3细胞的侵袭和迁移能力明显下降(P<0.01，图1)。细胞上皮细胞间质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)相关蛋白表达水平的分析结果显示，随SI-4650浓度增加，SKVO-3细胞中上皮细胞表型标志物钙粘蛋白(E-cadherin)相对表达量增加，而间质细胞标志物钙粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)相对表达量明显减少，基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的相对表达水平也显著降低(P<0.01，图2、表4)。提示SI-4650抑制SKVO-3细胞的侵袭、迁移能力，机制可能与抑制SKVO-3细胞上皮细胞间质化进程相关。

Fig. 1 Effects of SI-4650 on invasion and migration of SKVO-3 cells

Fig. 2 Effects of SI-4650 onthe expressions of EMT-related proteins in SKVO-3 cells

2.4 SI-4650对SKVO-3细胞周期的影响

流式细胞术检测结果表明，SI-4650处理可引起G0/G1期细胞数量从(50.54±2.17)%减少为 (30.09±1.34)%，而S期细胞数量从(25.50± 2.04)%明显增多至(42.12±3.76)%，呈浓度依赖性改变(表5)，与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示SI-4650可诱导SKVO-3细胞发生S周期阻滞，抑制细胞增殖。

Tab. 4 Effects of SI-4650 on EMT-related protein expressions of SKVO-3 n=3)

Tab. 5 Effects of SI-4650 on cell cycle of SKVO-3 cells(%, n=3)

2.5 SI-4650对SKVO-3细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测凋亡细胞比例实验结果表明，SI-4650处理后，随药物浓度增高FITC-Annexin V(+)的凋亡细胞比例从0.41%逐渐增多至43.51%(图3)，与正常对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示SI-4650可诱导SKVO-3细胞发生凋亡。进一步Western blot分析证实(图4，表6)，SKVO-3细胞中Bax表达上调、Bcl-2表达下调，Bax/Bcl-2比值升高，Caspase3剪切增多，活性小片段c-Caspase3增加，灰度分析差异均具有统计学意义(P<0.01)。此外流式细胞仪检测SKVO-3细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)结果显示，随着SI-4650浓度的逐渐增高，线粒体膜电位逐渐降低(P<0.01，表7)。以上结果提示，SI-4650诱导SKVO-3细胞发生线粒体依赖的内源性细胞凋亡。

Fig. 3 Effects of SI-4650 on apoptosis of SKVO-3 cells

Fig. 4 Effects of SI-4650 on the expressions of apoptosis-related proteins in SKVO-3 cells

3 讨论

在妇科恶性肿瘤中，卵巢癌由于发生位置不易觉察，症状不明显，导致患者就诊时多为晚期症状且出现肿瘤转移。手术和化疗等方式治疗后，仍有超过50%患者转移复发，五年生存率低于50%[9]。因此急需研发高效抗人卵巢癌的新型药物用于临床治疗。

细胞中多胺(polyamine, PA)由精脒(spermidine, Spd)、精胺(spermine, Spm)和腐胺(putrescine, Put)组成，是存在于所有真核细胞中的阳离子烷基胺，对细胞增殖、分化、发育等重要生理过程至关重要[10]。SMO在多胺代谢途径中，以Spm为底物，催化产生Spd、3-氨基丙醛和H2O2[11]。研究报道在幽门螺杆菌感染诱发胃癌的过程中，胃上皮细胞SMO高表达，酶促反应产物3-氨基丙醛转化成的丙烯醛和H2O2的大量产生是导致细胞DNA受损，成为诱发胃癌的重要因素；抑制SMO则显著减弱组织细胞DNA损伤，降低胃癌发生的几率[12]。此外，SMO与前列腺癌、结肠癌和肺癌等恶性肿瘤的发生、发展及预后均密切相关[3-5]。SI-4650是本课题组前期筛选获得的一种靶向SMO的新型小分子抑制剂，为探索SI-4650是否具有抗人卵巢癌的药理学活性及其潜在的临床应用价值，本研究分析了SI-

Tab. 6 Effects of SI-4650 on apoptosis-related protein expressions and mitochondrial function of SKVO-3 n=3)

4650对人卵巢癌SKVO-3细胞可能的抗肿瘤作用，及其对多胺代谢、细胞周期、诱导凋亡、侵袭和迁移的影响。

结合HPLC、流式细胞仪检测等实验结果，本研究首先证实SMO的靶向抑制剂SI-4650能够进入SKVO-3细胞内，发挥SMO抑制剂的作用，阻滞SMO催化的酶促反应，导致反应产物Spd和ROS含量下降，以及总多胺含量的减少。但实验中发现，SMO 酶促反应底物Spm含量并未升高，反而明显下降，我们推测由于SI-4650显著抑制SMO酶活性，干扰多胺代谢正常途径，打破细胞多胺含量和代谢稳态，从而激活细胞多胺跨膜转运系统，引起堆积的Spm等多胺成分经细胞膜转运至胞外，更进一步加重细胞中总多胺下降程度，其真正的机制有待进一步研究。鉴于减少细胞中多胺含量可有效抑制肿瘤细胞增殖[13]，本研究进一步探究了SI-4650对SKVO-3细胞增殖作用的影响。CCK8实验证实，SI-4650显著抑制人卵巢癌SKVO-3细胞的增殖，处理SKVO-3细胞48 h的IC50值为(68.13±5.48)μmol/L。肿瘤细胞抑制率与SI-4650作用时间和剂量呈正相关性。以上结果提示SI-4650具有高效杀伤人卵巢癌SKVO-3肿瘤细胞的作用，其机制与SI-4650抑制SMO活性，干扰多胺代谢，降低肿瘤细胞中总多胺含量有关。

对SI-4650抗肿瘤机制研究发现，SI-4650不仅引起SKVO-3细胞S期周期阻滞，同时诱导凋亡抑制蛋白Bcl-2表达减少而促凋亡蛋白Bax表达增加，Bax二聚体在线粒体膜聚集，引起膜通透性增加，线粒体电位降低，从而释放出线粒体内促凋亡因子，启动Caspase级联反应，剪切活化的c-Caspase-3增加，最终导致细胞凋亡。以上结果与内源性线粒体途径凋亡特质相一致[14]，提示SI-4650抗肿瘤机制可能还有S期周期阻滞和诱导内源性线粒体途径凋亡。黄娇娇等[15，16]发现SI-4650对人黑素瘤A375、人结肠癌CT-26细胞的抗肿瘤机制包括细胞凋亡和自噬性死亡，但在本研究中并未见明显自噬现象，可能与不同肿瘤细胞具有不同的遗传背景，对SI-4650敏感性差异等相关。

肿瘤细胞向周围组织浸润扩散和远端器官转移决定其恶性度，也是肿瘤临床治疗的重点和难点。EMT是恶性肿瘤细胞发生侵袭和转移的重要病理基础，与肿瘤细胞侵袭、迁移能力密切相关[17]。本研究发现，与未使用SI-4650处理细胞相比较，SI-4650处理后，SKVO-3细胞表型更趋向运动能力弱的上皮表型细胞，具体表现为E-cadherin相对表达量增加，N-cadherin、Vimentin相对表达量减少，SKVO-3细胞穿过Transwell膜孔的迁移能力明显降低；同时细胞合成的基质金属蛋白酶MMP-2、MMP9减少，降解细胞外基质的能力减弱，穿过Transwell基质胶膜孔的侵袭能力也显著下降。提示SI-4650有效抑制SKVO-3细胞侵袭、迁移能力，其机制与SI-4650抑制SKVO3细胞EMT进程相关。有学者研究报道，多胺含量更高的肿瘤细胞可大量合成释放如：丝氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶、组织蛋白酶等蛋白酶，进而降解周围组织，促使肿瘤细胞侵袭迁移，增强肿瘤细胞恶性度[18]。本研究发现SI-4650抑制SMO酶活性，干扰多胺代谢，降低多胺含量，同时基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9表达显著下降，与文献报道相符。因此分析，SI-4650可能通过抑制肿瘤细胞的EMT进程，肿瘤细胞向粘附力强的稳定上皮细胞形态转化，减弱运动能力，降低肿瘤细胞降解细胞外基质能力的方式，实现高效抑制人卵巢癌SKVO-3细胞侵袭、迁移。

本研究通过体外细胞培养实验，证实SI-4650靶向性抑制多胺代谢途径关键酶SMO的酶活性，一方面通过干扰多胺代谢，减少肿瘤细胞中多胺含量，抑制肿瘤细胞生长；一方面诱导细胞凋亡直接杀伤肿瘤细胞；同时干扰肿瘤细胞的侵袭和迁移能力，通过多途径共同发挥抗肿瘤作用。与其他抗肿瘤药物相比较，SI-4650有可能实现更有效的抗肿瘤效应。但SI-4650在机体中是否依旧有效，尚需进一步研究。

综上所述，本研究证实SI-4650作为一种新型SMO小分子抑制剂，可抑制人卵巢癌SKVO-3细胞的增殖、侵袭和迁移。其机制可能与通过抑制SMO活性、干扰多胺代谢引起的多胺含量减少有关；SI-4650还可将细胞阻滞于S期、诱导内源性线粒体途径细胞凋亡发生以及阻滞肿瘤细胞EMT进程，SI-4650在卵巢癌临床治疗上具有潜在的应用价值。