地塞米松联合缬沙坦对慢性阻塞性肺疾病小鼠保护作用及机制探讨*

李永荣， 谢海彬， 李 红， 孙 杰

(1. 甘肃中医药大学附属医院肺病科， 兰州 730020； 2. 甘肃中医药大学附属医院老年病科， 兰州 730020；3. 深圳市罗湖区中医院呼吸科， 深圳 518001； 4. 广州中医药大学第一附属医院心肺康复科， 广州 510405)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种常见的呼吸系统疾病。COPD定义为气道进行性下降和呼吸短促，这与氧化应激和慢性炎症有关，可导致体重减轻和组织消耗。吸烟是引起COPD的主要原因之一[1]。然而，现有的治疗方法仅通过减少疾病连锁反应来帮助改善COPD患者生活质量。糖皮质激素在控制气短方面有益处，但在减少炎症方面效果很差，特别是长期使用[2]。此外，吸烟与糖皮质激素抵抗相关[3]。因此，我们需要更多关于COPD治疗药物的研究。缬沙坦在临床上广泛用于治疗高血压、心力衰竭和糖尿病肾病。此外，缬沙坦对香烟所致小鼠肺损伤具有抗氧化和抗炎作用[4]。我们假设地塞米松联合缬沙坦可以更有效对吸烟诱导COPD发挥保护作用。因此，本研究旨在探讨地塞米松和缬沙坦联合应用对吸烟诱导COPD小鼠的保护作用，并对其机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

缬沙坦(北京诺华制药有限公司)；地塞米松(吉林敖东药业集团延吉股份有限公司)；芙蓉牌香烟(湖南中烟工业有限责任公司)；比色诊断试剂盒及ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。

1.2 实验动物及分组

40只雄性C57BL/6小鼠(20～25 g)，购于甘肃中医药大学动物中心。在整个研究过程中对动物处理均按照国家颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》和甘肃中医药大学研究伦理委员会要求执行。雄性C57BL/6小鼠随机分为5组(n=8)：对照组、COPD组、地塞米松组、缬沙坦组和地塞米松+缬沙坦联合处理组。对照组小鼠腹腔注射生理盐水，同时暴露于室内空气中；COPD组小鼠持续8周进行香烟暴露，5日/周，2次/日，每次75 min。地塞米松组小鼠在香烟暴露8周基础上，在5～8周香烟暴露前30 min腹腔注射地塞米松(2 mg/kg)，5日/周，1次/日[5]；缬沙坦组小鼠在香烟暴露8周基础上，1～8周香烟暴露前30 min腹腔注射缬沙坦(30 mg/kg)，5日/周，1次/日[6]；地塞米松+缬沙坦联合处理组小鼠在香烟暴露8周基础上，5～8周香烟暴露前30 min腹腔注射地塞米松(2 mg/kg)，5日/周，1次/日，同时1～8周香烟暴露前30 min腹腔注射缬沙坦(30 mg/kg)，5日/周，1次/日。8周处理后，提取各组小鼠肺组织，并收集支气管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid, BALF)，进行HE染色和相关生化检测。

1.3 BALF和肺组织样本采集

各组小鼠8周处理后，腹腔麻醉。然后将所有小鼠左肺置于10%福尔马林中进行固定。取小鼠右肺用6 ml无菌生理盐水灌洗5次，收集BALF，BALF在4 000 r/min下离心10 min。BALF细胞悬浮在1 ml生理盐水中，并用血细胞仪进行细胞分化计数。

1.4 组织病理学检查

病理组织学检查，左肺中段用石蜡包埋。从每个肺样本中切取3～4 mm切片，用HE染色进行组织病理学检查。用放大镜对载玻片进行扫描。根据肺病变的严重程度，按0.5～4分进行评分：0.5=轻微，1=轻度，2=中度，3=严重，4=非常严重[5]。

1.5 氧化应激、一氧化氮及炎症参数测定

采用比色诊断试剂盒检测BALF中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性，以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)和一氧化氮(nitric oxide, NO)含量；采用ELISA试剂盒检测BALF中基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)活性，以及细胞内黏附分子(intracellular adhesion molecule 1, ICAM-1)和C反应蛋白(c-reactive protein, CRP)含量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 联合处理对组织病理学影响

采用HE染色评价联合处理对肺组织病理改变的保护作用。如图1所示，COPD组小鼠支气管上皮细胞损伤，杯状上皮细胞化生，炎性细胞浸润，粘液分泌，支气管腔细胞阻塞；此外，上皮细胞坏死，肺泡充血，肺泡间壁破坏(肺气肿)。地塞米松组扩张支气管周围可见中度淋巴细胞浸润，伴有局灶性鳞状上皮化生。缬沙坦组支气管扩张，可见杯状细胞增生，周围有少量慢性炎症细胞。联合处理组支气管扩张伴轻度杯状细胞增生，联合处理组各项指标与COPD、地塞米松和缬沙坦组相比有明显下降趋势。病理组织学结果表明COPD模型成功建立，而联合处理对COPD病理损伤有显著改善作用(表1)。

Fig. 1 Typical HE staining of lung tissues in each group (100 μm). Control group showed normal bronchiole with intact lining of respiratory epithelium (blue arrow); COPD group showed necrosis of epithelial cells and dilated heavily congested alveoli with destructed wall in between (blue arrows); Dexamethasone group showed moderate lymphocytic infiltrate (red arrow) around dilated bronchus with focalsquamous metaplasia (blue arrow); Valsartan group showed dilated bronchi lined with goblet cellular hyperplasia (blue arrow) surrounded by few chronic inflammatory cells (red arrow); Combined group showed dilated bronchi lined with mild goblet cellular hyperplasia (blue arrow)

Tab. 1 Histopathological score and NO content in BAFL of mice in each n=8)

2.2 联合处理对BALF氧化应激参数影响

如表2所示，与对照组相比，COPD组小鼠BALF中SOD水平降低，MDA水平增加(P均< 0.05)。与COPD组相比，联合处理组小鼠BALF中SOD明显升高，MDA水平降低(P均<0.05)。另外，联合处理组与地塞米松和缬沙坦组相比，SOD升高，MDA降低，均有统计学差异(P均<0.05)。联合处理可提高COPD小鼠SOD抗氧化能力，降低MDA含量。

Tab. 2 Comparison of oxidative stress parameters in BAFL of mice in each n=8)

2.3 联合处理对BALF中NO含量影响

内皮细胞释放NO促进平滑肌松弛。如表1所示，与对照组相比，COPD组小鼠BALF中NO水平降低(P<0.05)。与COPD组相比，联合处理组小鼠NO水平升高(P<0.05)。然而，联合处理组与地塞米松和缬沙坦组相比，NO含量升高(P<0.05)。

2.4 联合处理对BALF炎症参数影响

如表3所示，与对照组相比，COPD组小鼠BALF中CRP、MMP-9和ICAM-1水平升高(P均<0.05)。与COPD组比较，联合处理组CRP、MMP-9和ICAM-1降低(P均<0.05)。此外，与地塞米松组和缬沙坦组相比，联合处理组CRP、MMP-9和ICAM-1水平降低(P均<0.05)。结果表明，地塞米松与缬沙坦合用可抑制COPD小鼠炎症细胞因子生成，从而抑制COPD引起的炎症反应。

Tab. 3 Comparison of inflammatory parameters in BAFL of mice in each n=8)

2.5 联合处理对BALF炎性细胞影响

如表4所示，与对照组相比，COPD小鼠BALF中活细胞百分比降低，淋巴细胞和巨噬细胞总数增加(P均<0.05)。与COPD组相比，联合处理组活细胞总数增加，巨噬细胞和淋巴细胞减少(P均< 0.05)。与地塞米松组和缬沙坦组相比，联合处理组活细胞百分率提高，淋巴细胞总数减少，巨噬细胞总数增加(P均<0.05)。

Tab. 4 Comparison of inflammatory cell parameters in BAFL of mice in each n=8)

3 讨论

COPD是一种与气道阻塞和肺部异常炎症反应相关的慢性气道炎症性疾病。慢性香烟烟雾暴露是慢性炎症的主要原因，导致气道重塑、肺泡组织破坏、进行性粘液高分泌和肺功能下降[7]。类固醇治疗对COPD患者是有益的，但其结果受到一些患者不确定和多变临床反应的限制。此外，大剂量类固醇对COPD患者肺功能迅速下降，并显示出许多副作用[8]。本研究通过组织病理学检查确定COPD模型的建立(支气管上皮细胞损伤，杯状上皮细胞化生，炎性细胞浸润，粘液分泌和支气管腔细胞阻塞，上皮细胞坏死，肺泡充血和肺泡壁破坏)。我们的研究还表明，与单独处理相比较，地塞米松和缬沙坦联合处理可通过减少氧化应激、炎症介质和组织病理学更有效抑制COPD。

COPD发病机制目前尚不清楚。众所周知，氧化应激会加剧气道炎症。由于烟雾中含有自由基和活性氧，对气道上皮细胞和炎症反应有直接损害作用[9]。肺部慢性炎症和支气管上皮细胞损伤后，SOD合成下降，MDA水平升高，导致机体失代偿。在本研究中，腹腔注射缬沙坦后SOD活性增加，可能与其通过抑制5-脂氧合酶和环氧合酶，以及减少循环中性粒细胞数量和超氧自由基产生有关。此外，缬沙坦还可以通过自由基清除作用消除超氧化物自由基，并通过抑制TNF-α和IL-1b诱导SOD酶基因表达[4]。缬沙坦降低MDA浓度的作用可能是通过其抗氧化和清除自由基的特性来实现的[10]。NO由L-精氨酸通过NO合酶获得。许多研究表明NO是导致肌肉松弛和气道高反应性减弱的重要因素[11]。内皮源性NO失活与氧化应激增加有关，特别是超氧自由基产生[12]。本研究结果表明，联合处理组与地塞米松或缬沙坦组比较，MDA含量降低，SOD活性和NO含量升高。因此，联合处理可能通过抗氧化作用对香烟诱导COPD起保护作用。

CRP可作为COPD治疗期间炎症监测的指标[13]。肺内侵袭性防御系统和保护性防御系统(蛋白酶和抗蛋白酶)之间失衡可能在COPD的发病机制中起重要作用。有三类重要的蛋白酶，包括基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)被认为在COPD发展中起着关键作用。有研究发现COPD患者痰中MMP-9浓度可作为局部炎症标志物[14]。ICAM-1是一种重要的粘附分子，参与中性粒细胞和淋巴细胞转运等炎症过程，在抗原呈递中起辅助分子作用。一些研究指出ICAM-1表达在COPD发病机制中的作用[15]。COPD患者BALF中ICAM-1浓度升高，香烟烟雾提取物增加巨噬细胞产生ICAM-1[16]。缬沙坦作为血管紧张素受体拮抗剂，其降低ICAM-1的作用是通过抑制TNF-α、NF-κB活化和MMPs介导的[17]。在本研究中，与单独处理相比，联合处理显著降低CRP、MMP-9和ICAM-1，表明COPD症状减轻。而地塞米松对CRP、MMP-9、ICAM-1等炎症介质减少无明显影响。联合处理可预防COPD，并增强彼此的疗效。炎症是COPD发生发展的重要原因，它涉及到炎症细胞浸润，包括巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。炎症细胞也通过有效释放促炎细胞因子发挥关键作用。与地塞米松组和缬沙坦组相比，联合处理组活细胞百分率提高，淋巴细胞总数减少，巨噬细胞总数增加。

总之，本研究结果表明，与地塞米松或缬沙坦单独应用相比较，地塞米松联合缬沙坦可以对COPD小鼠发挥更有效的保护作用，其保护作用机制可能是通过其抗氧化和抗炎特性介导的。