6周有氧运动对高脂膳食的ApoE敲除小鼠骨骼肌钙调控的影响*

陈 均， 高 扬， 苏香楠， 于 亮,2△

(1. 北京体育大学运动人体科学学院， 北京 100084； 2. 北京体育大学体能训练学院， 北京 100084)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种慢性炎症疾病，当发生在下肢时临床特征为间歇性跛行、严重肢体缺血[1]，并伴有运动能力降低、骨骼肌功能受损[2,3](如收缩功能下降)等[4]。研究已证实，AS小鼠表现为运动能力下降、心肌/平滑肌肌浆网内钙调控失衡以及钙调控释放蛋白兰尼定受体(Ryanodine receptor，RyR)[5,6]和回收蛋白肌浆网钙ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)[7]表达异常，而有氧运动可逆转心肌肌浆网内的钙紊乱[8]以及相应的钙调控蛋白。目前未见有氧运动对AS小鼠骨骼肌肌浆网钙调控蛋白RyR及SERCA的影响报道。此外，越来越多的研究表明，载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)在AS发生发展中扮演关键角色。作为血浆脂蛋白的重要构成，ApoE是细胞表面的一类脂蛋白受体(如LDL受体)的配体，而ApoE缺失可导致循环血液中胆固醇积累进而诱发AS，并在此基础上予以高脂膳食喂养可以进一步加速AS形成[4]。然而，目前鲜有AS对骨骼肌肌浆网钙调控蛋白的影响的相关报道。基于此，本研究选取ApoE敲除小鼠作为研究对象，从骨骼肌肌浆网钙调控蛋白的角度入手，探讨六周有氧运动对ApoE敲除小鼠骨骼肌肌浆网钙调控蛋白的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

采用健康25只9周龄ApoE敲除小鼠(ApoE knockout mice，ApoE KO)和10只野生型C57BL/6J小鼠(wild type mice，WT)作为本实验的研究对象，购于北京维通利华实验技术有限公司(SCXK(京)2016-0006)，体重为(25±0.6)g。

ApoE KO鼠和WT鼠各随机分为三组：野生鼠组(WT)、ApoE敲除鼠喂高脂鼠组(KO)、ApoE敲除鼠喂高脂+有氧运动鼠组(KE)，每组10只。其中高脂饲料的成分：脂肪含量为21%(w/w)，胆固醇含量为1.5%(w/w)，购自北京科澳协力饲料有限公司；普通饲料的成分：脂肪含量为4～5%(w/w)，无胆固醇，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

所有动物饲养于北京体育大学科研中心小鼠饲养室内，分笼饲养，每笼3～4只。小鼠房温度维持在20～25℃，相对湿度维持在50%～70%，小鼠房提供模拟自然光照，周期为每天12 h，并保证小鼠的自由进食和饮水。本次实验方案被北京体育大学运动伦理委员会所批准。

1.2 运动方案

安静组小鼠正常笼中活动，运动组小鼠先进行1周适应性跑台训练，方案为：坡度0°，跑速12 m/min，持续时间15 min/d，运动频率每周5 d。

最大跑速测试方案 5只用于测定最大跑速的小鼠及有氧训练组小鼠在测试及运动训练前均进行3 d的适应性训练。

5只ApoE-/-小鼠在跑步机上进行最大跑速测试。测试方案为：初始速度为4.8 m/min，坡度为0°，持续5 min后，每3 min速度增加1.2 m/min，直至小鼠力竭。判断标准为小鼠在电网上连续停留3 s以上或接受100次电击[9]。最大跑速的测试结果为(27.0±2.4)m/min。

有氧运动正式训练方案：速度为最大跑速的40%(10.8 m/min)，运动强度持续时间40 min/d，运动频率每周3 d，共持续6周。

1.3 取材

所有小鼠取材均在最后一次运动结束后休息至少48 h后进行，小鼠麻醉后经心脏穿刺取血并脱颈处死，立即取小鼠双侧腿部腓肠肌，迅速称量，取约100 mg，然用锡纸包裹，标记，立刻投入液氮中。然后转入-80℃冰箱，保存待用。

1.4 骨骼肌蛋白提取

将100 mg骨骼肌加入800 μl裂解液A(已加入EDTA)中，匀浆机高速充分匀浆；于冰上静置10 min，涡旋振荡5 s，再于冰上静置10 min，涡旋振荡5 s，15 000 r/min，4℃离心10 min；取上清液于离心管中，于-20℃冻存备用。

1.5 组织Ca2+含量测定

根据钙(Ca)测试盒(C004-2-1)说明书，准确称取组织含量(50 mg)按重量(g)∶体积(ml)=1∶9的比例加入9倍体积的去离子水，冰水浴匀浆， 2 500 r/min，离心10 min，取10%的匀浆上清液待测，加入工作液，酶标仪(BIO-RAD，USA)测定吸光度计算出组织中Ca2+含量。根据以下计算公式：

注：单位为：mmol/gprot

1.6 Western blot测定骨骼肌蛋白表达

采用美国Pierce公司生产的蛋白浓度试剂盒，BCA方法测定骨骼肌的蛋白浓度。以上样蛋白量20 μg为一次上样量，根据测定的蛋白浓度计算蛋白上样量。采用美国life technologies公司生产的Bolt 3%～8%Bis-Tris Plus凝胶(用于测定RyR)以及Bolt 4%～12%Bis-Tris Plus凝胶，电泳分离目的蛋白(RyR、CaM、CaMKⅡ、SERCA1)及内参(β-actin)，而后采用美国Invitrogen公司的iBlot2进行转膜。5%脱脂奶粉封闭1 h，4℃一抗摇床过夜。一抗稀释比例为：RyR(1∶200，SC-376507)、CaM(1∶500，SC-5537)、CaMKⅡ(1∶500，SC-9035)、SERCA2(1∶1 000，SC-365098)以及内参蛋白β-actin(1∶ 1 000，SC-47778)。次日以1×TBST洗3次，每次10 min。加二抗(RyR(1∶2 000)，CaM(1∶2 000)，CaMKⅡ(1∶2 000)，SERCA2(1∶3 000)，β-actin(1∶2 500))室温孵育1 h，然后用1×TBST洗3次，每次10 min。洗膜后，加入发光液(Thermo 34095)，曝光结果采用Image Lab软件读取条带积分灰度值，结果用以下公式计算的比值表示。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 6周有氧运动对ApoE-/-小鼠骨骼肌Ca2+浓度的影响

与WT组相比，KO组Ca2+浓度显著性降低(WT组Ca2+浓度为(0.052±0.012)mmol/g prot，KO组Ca2+浓度为(0.028±0.007)mmol/g prot，P<0.01)，然而KE组Ca2+浓度无明显变化。但是，与KO组相比，KE组Ca2+浓度明显升高，KE组Ca2+浓度为 (0.045±0.013)mmol/g prot，P<0.01)。

2.2 6周有氧运动对ApoE-/-小鼠骨骼肌肌浆网钙释放蛋白表达的影响

通过Western blot发现，如表1、图1所示，与WT组相比，KO组骨骼肌RyR蛋白表达显著降低(P<0.01)，KE组骨骼肌RyR蛋白表达虽有下降趋势但无显著差异。KE组与KO组相比，骨骼肌RyR蛋白表达无明显变化。

由表1、图1可知，与WT组相比，KO组和KE组骨骼肌CaM蛋白的表达均无明显变化。与KO组相比，KE组骨骼肌CaM蛋白表达虽有降低趋势但无显著性。

如表1、图1所示，KO组与WT相比，骨骼肌CaMKⅡ蛋白表达显著低(P<0.05)。与KO组相比，KE组CaMKⅡ蛋白的表达无显著性变化。

Tab. 1 Mice skeletal muscle SR calcium releasing protein expression n=10)

Fig. 1 Mice skeletal muscle SR calcium releasing protein expression

2.3 6周有氧运动对ApoE-/-小鼠骨骼肌肌浆网钙回收蛋白表达的影响

通过Western blot发现，如表2、图2所示，与WT组比较，KO组骨骼肌SERCA1和SERCA2蛋白表达均明显降低(P<0.01)。KE组与KO组相比，骨骼肌SERCA1和SERCA2蛋白的表达均显著增加(P<0.05)。

Tab. 2 Mice skeletal muscle SR calcium uptake protein expression n=10)

Fig. 2 Mice skeletal muscle SR calcium uptake protein expression

3 讨论

机体细胞得以维持正常生理功能的基础钙离子浓度稳态有关。越来越多的证据表明，Ca2+在AS中扮演重要作用，但Ca2+在疾病发病机制中的具体机制仍不清楚，尚待进一步研究。Van等[10]以4周龄ApoE-/-小鼠为研究对象，发现ApoE-/-小鼠心肌细胞内Ca2+含量无明显变化。本研究结果显示，ApoE-/-小鼠经6周高脂膳食喂养后，骨骼肌Ca2+浓度明显降低。与Van等研究结果不一致，本实验采取6周高脂膳食喂养ApoE-/-小鼠，而Van等的实验经过4周干预且组织类型为心肌，因此，推测造模时间以及组织类型差异对骨骼肌Ca2+浓度有影响。此外，目前关于AS中骨骼肌肌浆网Ca2+之间关系的报道尚少，相关机制仍不明确，故未来可深入探究。

众所周知，运动作为一种新的防治AS的有效手段，正逐渐受到学者关注。研究已证实，运动训练能够通过预防肌萎缩，继而改善骨骼肌氧化能力引起的毛细血管稀疏以及降低心衰小鼠的氧化应激，从而逆转外周动脉引起的骨骼肌肌病；此外，运动还可以预防心血管疾病患者的Ca2+稳态失调[8]，但相关机制仍不明确。越来越多的研究表明，在心肌/骨骼肌中，有氧运动训练能够增加心衰小鼠的心脏收缩力，并改善Ca2+稳态，推测可能是参与了肌浆网Ca2+释放(不同的DHPR亚基和RyR)和再摄取(SERCA和NCX)蛋白表达显著降低有关[11]。本实验研究结果显示，6周有氧运动对ApoE-/-小鼠高脂膳食喂养后，骨骼肌Ca2+浓度显著升高。目前，关于运动对动脉粥样硬化中Ca2+相关调控机制仍不清楚，需要进一步的探索研究。

肌浆网钙释放蛋白主要由RyR通道蛋白构成，在哺乳动物中表达的RyR有三种类型：RyR1、RyR2和RyR3。其中，RyR1在骨骼肌中表达；RyR2在心肌中广泛表达；RyR3在多种组织(神经系统和膈肌)中以低水平表达。RyR蛋白的活性主要受到细胞溶质Ca2+浓度、CaM和CaMKII的影响。CaMKⅡ由钙结合钙调蛋白(Ca2+/CaM)激活，磷酸化多种底物，协调和调节Ca2+介导的细胞功能改变，而CaMKⅡ活性受到CaM和Ca2+浓度的共同调节[12]。目前，大多数研究认为AS对肌浆网钙释放蛋白表达的影响降低。冯利霞等[5]观察到ApoE-/-小鼠经喂养高脂喂养20周后，ApoE-/-小鼠平滑肌细胞内RyR3蛋白表达显著下降，同时随着小鼠周龄的延长其RyR3的表达亦降低。但也有部分研究认为AS中RyR蛋白的表达上升。经高脂饲料喂养20周后，ApoE-/-小鼠平滑肌RyR3蛋白的表达明显增加，进而导致AS斑块的形成，推测可能是由于miR-29b表达下降所引起的[6]。本实验研究结果显示，ApoE-/-小鼠经6周高脂膳食喂养后，骨骼肌RyR蛋白表达明显降低，与上述研究结果相一致，尽管组织类型、蛋白亚型有差异，但可能其相关机制一致。据前文可知，RyR通道活性受CaMKⅡ和CaM蛋白影响，当ApoE-/-小鼠骨骼肌RyR蛋白表达下降，进而引起RyR通道活性减弱，导致骨骼肌CaMKⅡ蛋白的表达明显降低；而骨骼肌组织内Ca2+浓度的降低，促使骨骼肌CaMKII活性降低，导致肌浆网钙释放功能减弱。因此，本实验结果显示，骨骼肌CaMKⅡ蛋白的表达显著降低，而CaM蛋白表达无明显变化。故未来可深入探究AS对骨骼肌肌浆网钙释放蛋白的影响。

目前研究已证实长期的有氧运动训练可以引起心肌/骨骼肌肌浆网钙调节蛋白发生适应性变化。与大多数人的研究一致，认为运动能够使肌浆网上RyR蛋白表达增加[13]。例如，Bueno等[14]以肾上腺素受体敲除(ARKO)小鼠为研究对象，经8周的有氧运动训练，发现比目鱼肌RyR蛋白表达显著升高。然而亦有部分文献报道，Mänttiri等[15]发现，经15周有氧低强度训练干预后，小鼠腓肠肌和股直肌RyR蛋白表达未见明显变化，可能与机体产生了适应性有关。本实验结果显示，6周有氧运动对ApoE-/-小鼠高脂膳食喂养后，骨骼肌RyR蛋白表达无明显变化。与Mänttiri等研究结果一致，但与Morán研究结果不一致。可能与运动强度、干预周期以及研究对象不同而引起的。综合以上研究结果，6周有氧运动对ApoE-/-小鼠高脂膳食喂养后，骨骼肌RyR蛋白表达无明显变化；此外，骨骼肌CaMKⅡ和CaM蛋白表达均无统计学差异，推测可能与骨骼肌RyR蛋白表达无明显变化有关。目前关于运动与AS模型中骨骼肌肌浆网钙释放蛋白表达之间的研究尚少，相关机制仍不清晰，故未来可进一步深入研究以厘清二者关系。

SERCA作为肌浆网上Ca2+的回收通道蛋白，将Ca2+运回肌浆网官腔，从而控制肌浆网中Ca2+的浓度。目前，现有研究集中探讨了AS模型中心肌/平滑肌SERCA蛋白的表达。近期研究发现，ApoE-/-小鼠高脂膳食喂养16周后，ApoE-/-小鼠平滑肌SERCA2b蛋白的表达显著下降[7]。此外，亦有研究探讨了人体AS模型中骨骼肌SERCA蛋白表达之间的关系。Fodor等[16]以AS股骨截肢患者为研究对象，观察到骨骼肌SERCA1a蛋白的表达明显增加。本实验研究结果显示，ApoE-/-小鼠经6周高脂膳食喂养后，骨骼肌SERCA蛋白的表达明显降低。与上述研究结果一致[6]，但与Fodor等研究结果不一致。主要原因与研究对象不同，人体骨骼肌SERCA1a高表达表明在AS缺血性肌肉中存在代偿机制[16]。

目前普遍认为，长期的运动训练能够明显增强骨骼肌SERCA蛋白表达。例如，Bueno等[14]以心力衰竭的小鼠为研究对象，经过8周的有氧运动训练后，结果显示，小鼠骨骼肌SERCA1/SERCA2蛋白的表达均明显增加。但急性运动使骨骼肌SERCA蛋白表达降低。丁海丽等[17]观察到SD大鼠经一次性离心运动干预后，与对照组相比，发现比目鱼肌SERCA蛋白表达呈降低后逐渐回升趋势、在0 h、12 h、24 h和48 h均显著降低。SERCA2分别在慢肌纤维以及心肌中广泛表达，而SERCA1仅在快肌纤维中特异性表达[18]。因此，运动对骨骼肌SERCA不同亚型的影响机制也存在差异。例如，MELO等[19]以心肌梗塞大鼠为研究对象，经10周的有氧运动训练后，结果表明，心肌梗塞大鼠SERCA2蛋白的表达显著增加，进而恢复了心肌梗塞大鼠心室舒张功能，推测可能长期的耐力训练可以引起microRNA-1和microRNA-214的表达来调节心肌梗塞大鼠SERCA2a蛋白表达。也有研究报道了不一致的结果，Morissette等[20]进一步观察到AMPKα2激酶转基因小鼠心肌SERCA2明显增加，提示，运动诱导的心肌SERCA2a蛋白变化可能依赖于AMPKα功能。本实验研究结果显示，6周有氧运动对ApoE-/-小鼠高脂膳食喂养后，骨骼肌SERCA1/SERCA2蛋白表达明显增加。但是，目前运动对AS模型中骨骼肌SERCA蛋白表达的报道尚少，鉴于运动调控AS中骨骼肌SERCA的分子机制仍不明确，故未来可进一步在体内、体外实验上给予佐证，以期为运动训练防治AS提供有益策略。

综上所述，高脂膳食可使ApoE敲除小鼠骨骼肌Ca2+浓度降低、肌浆网钙释放作用和钙回收作用减弱，6周有氧运动训练能够显著提高其Ca2+浓度、促进肌浆网钙回收作用。