基于下丘脑－垂体－性腺轴探讨刺玫果的类性激素作用

孟永海，毛宏宇，秦蓁，付敬菊，薛迎凤，王艳艳，翟春梅

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

刺玫果（Rosa davuricaPall.）广泛生长在大、小兴安岭原始森林之中，野生资源丰富，具有抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、抗衰老以及类性激素样等作用功效［1－4］。中医学对于人体的衰老、免疫力低下及性功能减退有着深刻的认识，通常以“肾藏精，主生殖”即“肾主生殖”理论为主［5］。目前公认“肾虚证”与下丘脑－垂体－甲状腺、性腺、肾上腺等轴功能失常密切相关［6－7］。下丘脑－垂体－性腺轴（HPG 轴）在哺乳动物的生长、发育以及生殖、衰老过程中发挥着重要的作用［8－9］。本研究通过肌内注射氢化可的松注射液制备肾阳虚大鼠模型［10］，考察刺玫果对雌性及雄性肾阳虚模型大鼠HPG 轴的调节作用，检测血清中相关激素指标，探讨其对雌雄不同性别的类性激素作用特点，为下一步的应用和开发提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

实验用普通级Wistar 大鼠（4 月龄）雌、雄各40 只，体质量为180～200 g，由青岛大任富城畜牧有限公司提供。饲养温度20～25 ℃，相对湿度50%～65%，正常昼夜光变化。将以上大鼠进行3 d的适应性喂养后，雌性大鼠和雄性大鼠分别随机分为模型对照组、阳性对照组、刺玫果治疗组和空白对照组，每组各10只。

1.2 药物与试剂

药材与制备：刺玫果购于大兴安岭加格达奇区，称取刺玫果粉采用8 倍量的70%乙醇回流提取2 次，每次2 h，将滤液合并低温旋干至无醇味，加适量水冷冻后放入冻干机中进行冷冻干燥，将刺玫果冻干粉保存备用。刺玫果冻干粉的提取率为26%，1.0 g 冻干粉相当于生药3.85 g/mL。

材料试剂：氢化可的松注射液（天津金耀药业有限公司，批号：1702081）；金匮肾气丸（哈药集团世一堂制药厂，批号：1812702）；五子衍宗丸（北京御生堂集团石家庄制药有限公司，批号：278023）；睾酮（T）Elisa试剂盒、雌二醇（E2）Elisa 试剂盒（Cloud－Clone Corp 公司，批号：L191105127、L191105135）；孕酮（P）试剂盒、黄体生成素（LH）试剂盒、促卵泡素（FSH）试剂盒、促性腺激素释放激素（GnRH）试剂盒（北京博奥拓达公司，批号：CK－E30580、CK－E30623、CK－E30597、CK－E30426）。

1.3 仪器

紫外可见分光光度计（WFZ－900－D4，北京瑞利分析仪器有限公司）；台式微量高速离心机（CT15RE，日本HITACHI）；实验型冷冻干燥机（LGJ－10 NS，北京亚星仪科科技发展有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 造模与给药方法

雌性大鼠造模与给药方法：模型对照组采用20 mg/（kg·d）氢化可的松肌内注射连续21 d，造模7 d后给予2 mL/d 剂量的蒸馏水灌胃给药14 d；阳性对照组采用20 mg/（kg·d）氢化可的松肌内注射连续21 d，造模7 d 后给予1 g/（kg·d）剂量的金匮肾气丸灌胃给药14 d；刺玫果治疗组采用20 mg/（kg·d）氢化可的松肌内注射连续21 d，造模7 d 后给予2 g/（kg·d）剂量的刺玫果提取物灌胃给药14 d；空白对照组采用1 mL/d生理盐水肌内注射连续21 d，7 d后给予2.0 mL/d 剂量的蒸馏水灌胃给药14 d。

雄性大鼠造模与给药方法：模型对照组采用25 mg/（kg·d）氢化可的松肌内注射连续12 d，按照2 mL/d 剂量的蒸馏水灌胃给药14 d；阳性对照组采用25 mg/（kg·d）氢化可的松肌内注射连续12 d，按照1 g/（kg·d）剂量的五子衍宗丸灌胃给药14 d；刺玫果治疗组采用25 mg/（kg·d）氢化可的松肌内注射连续12 d，按照2 g/（kg·d）剂量的刺玫果提取物灌胃给药14 d；空白对照组采用1 mL/d 生理盐水肌内注射连续12 d，按照2 mL/d剂量的蒸馏水灌胃给药14 d。

造模与给药方法见图1。

图1 造模与给药方法

1.4.2 测定指标与样品测试

在造模灌胃实验期间，每天对大鼠进行一般状态的观察，包括饮食活动、毛发变化以及精神状态等。记录各组实验大鼠的体质量变化。并在最后一次给药1 h后进行腹主动脉取血，在3 000 rpm 的条件下进行离心操作20 min，吸出血清后在－20 ℃的冰箱中保存备用。Elisa试剂盒检测各组实验大鼠血清中睾酮（T）、雌二醇（E2）、孕酮（P）、黄体生成素（LH）、促卵泡素（FSH）和促性腺激素释放激素（GnRH）的含量。取血后立即摘除大鼠的睾丸、子宫和肾脏，分别用电子天平进行精确的称重，并计算各组实验大鼠的脏器指数。

脏器指数（%）= 大鼠各组脏器湿重/大鼠体质量×100%

1.4.3 组织形态观察

采血后迅速摘取睾丸、卵巢和子宫，常规固定。用石蜡进行包埋操作，每份标本间断切为厚度约5 μm的5 张切片，并进行常规HE 染色。在Olympus 生物显微镜下，对其各组织形态变化进行观察。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件对所得实验数据做进一步的统计分析处理。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，符合正态分布的数据两两组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 动物造模情况

随着实验中肌内注射给药时间的逐渐积累，模型对照组大鼠相继出现了掉毛、怕冷喜暖、大便稀溏和精神不佳、活动量减少以及体质量减轻等符合肾阳虚证的症状。12 d后，以上症状更明显，个别动物出现死亡的情况，说明模型复制成功。结果发现雌鼠和雄鼠的刺玫果治疗组肾阳虚症状均得到了较大程度的改善，其精神状态稍弱于空白对照组。模型对照组的雄性大鼠肾阳虚症状比较重，阳性对照组死亡1只。雌性大鼠刺玫果治疗组由于实验操作失误，死亡1只，阳性对照组死亡2只。

2.2 实验前后各组大鼠平均体质量变化

实验前后各组雌性及雄性大鼠平均体质量变化见表1、表2。刺玫果治疗组雌性、雄性肾阳虚大鼠体质量均明显增加，体质量增幅稍高于阳性对照组，稍低于空白对照组，其中模型对照组大鼠的体质量下降较为明显。

2.3 各组大鼠脏器指数比较

雌性大鼠模型中，与空白对照组比较，模型对照组雌性大鼠的子宫脏器指数呈现降低的趋势（P<0.05）；刺玫果治疗组子宫脏器指数接近于空白对照组，且稍高于阳性对照组，但差异不具有统计学意义（P>0.05）。与空白对照组比较，模型对照组大鼠的肾脏指数呈极显著的升高趋势（P<0.01），阳性对照组大鼠肾脏指数呈现显著的升高趋势（P<0.05）；刺玫果治疗组与模型对照组相比肾脏指数呈现极显著的降低趋势（P<0.01）。雄性大鼠模型中，与空白对照组比较，模型对照组的大鼠睾丸指数呈显著降低的趋势（P<0.01）；刺玫果治疗组和阳性对照组的睾丸指数显著升高，与肾阳虚模型组比较差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；刺玫果治疗组大鼠的睾丸指数与模型对照组比较呈极显著的升高趋势（P<0.01），与阳性对照组比较呈现显著的升高趋势（P<0.05）。与模型对照组的肾脏指数比较，刺玫果治疗组的肾脏指数呈现显著的降低趋势（P<0.01）；与空白对照组比较，模型对照组和阳性对照组大鼠的肾脏指数呈现显著的升高趋势（P<0.01）。雌性大鼠及雄性大鼠各组脏器指数结果见表1、表2。

表1 各组雌性大鼠体质量及脏器指数的变化情况比较（±s）

表1 各组雌性大鼠体质量及脏器指数的变化情况比较（±s）

注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，**P<0.01。

?

表2 各组雄性大鼠体质量及脏器指数的变化情况比较（±s）

表2 各组雄性大鼠体质量及脏器指数的变化情况比较（±s）

注：与空白对照组比较，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

?

2.4 各组大鼠HPG轴相关指标比较

雌性各组大鼠血清中E2、P、LH、FSH、GnRH 水平变化情况见表3。雄性各组大鼠血清中T、LH、FSH、GnRH水平变化情况见表4。

如表3 结果显示，雌性大鼠中，与空白对照组比较，模型对照组、刺玫果治疗组血清中的E2和P 含量显著降低（P< 0.01，P< 0.05），阳性对照组中的E2极显著降低（P< 0.01）；与模型对照组比较，刺玫果治疗组中E2和P 的含量极显著增加（P< 0.01）。说明刺玫果可以有效改善雌性大鼠血清中E2和P 激素的分泌，并且可促进雌性大鼠的生殖内分泌。

表3 各组雌性大鼠HPG轴相关指标的变化情况比较（±s）

表3 各组雌性大鼠HPG轴相关指标的变化情况比较（±s）

注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

组 别空白对照组模型对照组阳性对照组刺玫果治疗组n 10 10 8 9剂量（g/kg）——1.0 2.0 E2（ng/mL）2.381 0±0.030 4 0.446 0±0.120 9##2.123 0±0.032 8**##2.276 0±0.129 9**#P（ng/mL）9.648 0±0.769 1 7.622 0±0.440 0##9.222 0±0.732 5**8.941 0±0.492 8**#LH（mIU/mL）14.624 0±0.598 2 25.038 0±2.711 5##16.111 0±1.484 0**##17.089 0±1.079 4**##FSH（IU/L）2.712 0±0.121 6 4.171 0±0.127 5##2.926 0±0.105 6**##2.677 0±0.173 2**GnRH（pg/mL）208.243 0±7.412 4 168.907 0±9.470 4##199.162 0±4.869 9**##217.102 0±18.446 1**

与空白对照组比较，模型对照组和阳性对照组血清中LH、FSH 的含量极显著升高（P< 0.01），刺玫果治疗组中的LH 含量极显著升高（P< 0.01）。与模型对照组比较，刺玫果治疗组和阳性对照组血清中所含LH、FSH 的含量极显著降低（P< 0.01）。可见，刺玫果治疗组血清中LH、FSH 浓度较模型对照组显著增加，说明刺玫果可以下调雌性大鼠LH、FSH 的分泌。

与空白对照组比较，模型对照组和阳性对照组血清中GnRH 的含量极显著降低（P<0.01）。与模型对照组比较，刺玫果治疗组和阳性对照组血清中GnRH含量极显著升高（P< 0.01）。刺玫果治疗组血清中GnRH 浓度较模型对照组显著增加，说明刺玫果可以上调雌性大鼠GnRH的分泌。

如表4 结果显示，雄性大鼠中，与空白对照组比较，模型对照组、阳性对照组、刺玫果治疗组血清中T的含量极显著降低（P< 0.01）。与模型对照组比较，刺玫果治疗组和阳性对照组血清中T的含量极显著升高（P<0.01）。说明刺玫果可以有效改善雄性大鼠血清中T 激素的分泌，并且可促进雄性大鼠的生殖内分泌。

表4 各组雄性大鼠HPG轴相关指标的变化情况比较（±s）

表4 各组雄性大鼠HPG轴相关指标的变化情况比较（±s）

注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

组 别空白对照组模型对照组阳性对照组刺玫果治疗组n 10 10 9 10剂量（g/kg）——1.0 2.0 T（ng/mL）4.172 0±0.005 2 3.689 0±0.005 3##4.242 0±0.011 3**##4.208 0±0.003**##LH（mIU/mL）15.513 0±0.529 7 23.808 0±0.624 2##18.039 0±0.889 9**##17.963 0±1.198 6**##FSH（IU/L）2.586 0±0.101 9 3.763 0±0.224 2##2.883 0±0.159 4**##3.015 0±0.045 6**##GnRH（pg/mL）180.867 0±11.053 3 153.403 0±9.135 2##169.359 0±12.564 0**#180.070 0±7.374 6**

与空白对照组比较，模型对照组、刺玫果治疗组、阳性对照组血清中LH 和FSH 的含量极显著升高（P< 0.01）。与模型对照组比较，刺玫果治疗组和阳性对照组血清中LH、FSH 的含量极显著降低（P<0.01）。刺玫果治疗组中所含LH、FSH 的浓度较模型对照组显著降低，说明刺玫果可以下调雄性大鼠LH、FSH的分泌。

与空白对照组比较，模型对照组血清中GnRH 的含量极显著降低（P<0.01），与空白对照组比较，阳性对照组血清中GnRH的含量显著升高（P<0.05），与模型对照组比较，刺玫果治疗组和阳性对照组血清中GnRH 的含量极显著升高（P< 0.01）。刺玫果治疗组中GnRH 浓度较模型对照组显著增加，说明刺玫果可以上调雄性大鼠GnRH的分泌。

2.5 雄性大鼠睾丸组织形态观察

将所摘取的睾丸组织进行常规固定，用石蜡包埋后再进行切片，常规HE 染色后，分别在200 倍和400 倍的光学显微镜下观察各个组织形态的变化。生精小管排列较为紧密、间质发达，有丰富间质细胞，为正常睾丸的组织形态，同时可以看到许多排列非常规则且层次较清晰地分布在生精小管内的精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞、精子细胞和精子等各级生精细胞。生精小管排列呈疏松状态、间质退化以及间质细胞较少是模型对照组的形态，睾丸的超微结构出现了明显破坏，在组织中可以看见较多的曲精小管内有精母细胞脱落（黑色箭头），局部间质中可见较多嗜酸性物质渗出（黄色箭头），未见明显炎症，见图2 A1～A2；生精小管发生了萎缩变化，各级生精细胞排列呈较松散且不规则的状态，并且精子的数量极少，见图2 A3～A4。在刺玫果给药组中，生精小管的排列较为紧密，间质退化的程度得到了改善，间质细胞较为丰富，组织中可见较多曲精小管内有精母细胞脱落（黑色箭头），间质未见明显异常，未见明显炎症，见图2 B1～B2；各级生精细胞在生精小管内可见，层次较为清晰，有精子，见图2 B3～B4。说明刺玫果可以修复肾阳虚大鼠睾丸组织的退行性改变。

2.6 雌性大鼠卵巢组织形态观察

在正常对照组雌性大鼠卵巢内可以看到各级卵泡，并且有新鲜黄体。在模型对照组中卵巢内只有少数的原始卵泡，无优势卵泡，少量的淋巴细胞浸润在局部可见（黑色箭头），未见黄体，见图3 A1～A4；刺玫果治疗组可见各级卵泡，未见黄体，多见卵泡内有颗粒细胞凋亡，核固缩深染或碎裂（黑色箭头）；卵细胞形态结构正常，未见明显炎症见图2 B1～B4。说明刺玫果可以促进大鼠的卵巢发育。

图2 雄性大鼠睾丸组织形态（HE染色）

图3 雌性大鼠卵巢组织形态（HE染色）

2.7 雌性大鼠子宫组织形态观察

正常对照组大鼠子宫管径比较粗，并且其内膜较为深厚，分布有丰富的子宫腺体，在单层柱状上皮细胞中呈现整齐排列的状态；模型对照组黏膜上皮可见上皮细胞点状凋亡，核发生碎裂或溶解（黑色箭头）；固有层子宫腺数量少，少量腺上皮细胞胞质空泡化（黄色箭头），间质致密，伴有少量的淋巴细胞浸润（红色箭头），并且在局部可见嗜酸性增强（蓝色箭头），子宫内膜变薄，无子宫腺体，见图4 A1～A4。刺玫果治疗组黏膜上皮局部可见增生（黑色箭头），并可见少量上皮细胞核固缩深染（黄色箭头）；固有层子宫腺数量较少，间质致密，伴有较多淋巴细胞浸润（红色箭头），子宫内膜较模型对照组厚，有少量子宫腺体，见图4 B1～B4。说明刺玫果可以增强大鼠的子宫发育。

图4 雌性大鼠子宫组织形态（HE染色）

3 讨论

临床肾阳虚患者的肾上腺皮质功能较低，进行治疗时需要长期使用大剂量的外源性皮质激素，过量使用肾上腺皮质激素，可对下丘脑－垂体－肾上腺的反馈调节产生抑制，若突然停用皮质激素治疗，会暴露HPG 轴所导致的抑制状态，表现出不同程度的HPG 轴功能低下的状态，出现肾阳虚的症状［11－12］。本研究以此为依据复制了肾阳虚大鼠模型。

中医学认为肾藏精，主生殖，在人类的生长及发育中发挥着非常重要的作用，且肾中阳气是生殖功能的主要动力来源。肾中阳气的兴衰由性激素的水平变化所反映，肾虚发生的基础是内分泌环境的改变［12］。在临床中发现，多数肾虚患者会在病程中伴见性激素水平的变化［13］，在男性血清中T水平会显著降低，女性血清中E2、P 水平也呈现显著降低，在中老年肾阳虚证患者中更是主要表现为较严重的性激素紊乱症状［14］。下丘脑接受上级神经系统传来的信息后，可以促进GnRH 释放，而后GnRH 被运输到腺垂体，起到促进FSH 以及LH 释放的作用，LH 可进一步刺激睾酮的分泌和合成［15］。卵巢组织具有排卵和内分泌的功能，在女性的生殖功能及性特征中发挥着非常重要的作用。许多妇科内分泌疾病，如不孕症等，都是由卵巢功能的失调所导致的［16－17］。女性生殖与肾功能关系密切，不孕症的病机本质是肾虚，使内分泌失常，机体不能正常排卵，如肾阳亏虚，命门火衰，或冲任二脉及胞宫中阴寒内滞，都将使女性难以进行摄精受孕［18］。

人体内分泌系统主要有三大分支，即下丘脑－垂体－甲状腺轴、下丘脑-垂体-肾上腺轴、下丘脑－垂体－性腺轴［19］。下丘脑和垂体可以说是人体内分泌的控制中心，下丘脑－垂体－性腺轴则是控制人体性激素分泌的分支。人体内分泌系统中HPG轴机体调节机制示意图见图5。下丘脑分泌GnRH，GnRH可促进垂体分泌LH、FSH和泌乳素（PRL），PRL作用在乳腺上，促进乳腺发育及乳汁的产生。LH和FSH作用在女性的卵巢上，促进卵巢分泌P和E2；作用在男性的睾丸上，促进睾丸分泌T。当然女性的卵巢也会分泌少量的睾酮，男性的睾丸也会分泌少量的P和T。E2可促使女性生殖系统的发育及第二性征的出现及维持。T是重要的雄性激素，同时可以促进骨骼和肌肉的发育。其中血清PRL、P、E2和T的含量又会有一个反馈机制到达下丘脑，当血中这些激素的含量升高或降低时，下丘脑收到这个反馈信息后会调整GnRH的分泌，以调整LH、FSH、PRL的分泌，最终调整P、E2、T的含量［19－21］。

图5 人体内分泌系统中HPG轴机体调节机制示意图

睾丸间质细胞以胆固醇为原料合成雄激素，主要包括下列步骤：①胆固醇从线粒体膜外转运到膜内参加类固醇合成，转运过程中需要类固醇急性反应蛋白（StAR）参与，StAR 加速胆固醇向胆固醇侧链裂解酶细胞色素P450（P450scc）的传递，这是睾酮合成的限速步骤。②胆固醇转到线粒体内膜后，在P450scc 催化下变成孕烯醇酮，P450scc是类固醇合成的限速酶。③孕烯醇酮可直接变为孕酮，两者在17－羟化酶/17－20裂解酶细胞色素P450（P450c17）作用下依次转变为17-羟孕烯醇酮（17－羟孕酮）和去氢表雄酮（雄烯二酮），P450c17 是另一个限速酶。④去氢表雄酮在17β－羟基类固醇脱氢酶（17β－HSD）催化下可转变为雄烯二酮。⑤3β－HSD 可催化雄烯二酮转变为睾酮，3β－HSD 也是类固醇生物合成的限速酶。影响睾酮合成环节的因素最终可引起睾酮合成的变化。另外，少量雄激素也可经芳香化酶作用转化为雌激素［11，21］。

本研究中，大鼠造模后出现明显的肾阳虚证表现，且体质量明显减轻，在雄鼠血清中T、GnRH 的含量呈显著下降（P< 0.01），LH、FSH 的含量呈显著升高（P<0.01），垂体、下丘脑以及睾丸组织均发生退行性改变，在给药后的阳性对照组、刺玫果治疗组大鼠血清中T、GnRH 的含量显著升高（P<0.01），LH、FSH 的含量显著下降（P<0.01），体质量也有所增加，体内垂体、下丘脑以及睾丸组织的退行性改变均得到了有效改善；雌鼠血清中E2、P、GnRH 的含量显著下降（P<0.01），LH、FSH的含量显著升高（P<0.01），下丘脑、垂体和卵巢以及子宫组织发生了退行性改变，阳性对照组、刺玫果治疗组血清中E2、P、GnRH 的含量显著升高（P<0.01），LH、FSH的含量显著下降（P<0.01），体质量增加，卵巢和子宫脏器指数高于模型对照组，下丘脑、垂体、卵巢和子宫组织退行性改变得到改善。

综上，刺玫果可有效上调肾阳虚大鼠血清中T、E2、P、GnRH 的含量，下调LH、FSH 的含量，并且可使肾阳虚模型大鼠的下丘脑、垂体以及性腺组织形态的退行性改变得到有效的改善。本研究结果表明，刺玫果对雌性及雄性大鼠的生殖及内分泌功能均具有较好的促进作用，为刺玫果临床应用提供了一定的实验依据。